Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/11219
Title: Μελέτη μηχανισμών αντιγραφής και επιδιόρθωσης του γενετικού υλικού με τεχνικές λειτουργικής μικροσκοπίας και χρήση αλγορίθμων επεξεργασίας-ανάλυσης εικόνας
Other Titles: Study of replication and DNA repair mechanisms with the use of functional imaging techniques and algorithms for image processing and analysis
Authors: Γιακουμάκης, Νικόλαος Νικηφόρος
Keywords: Αντιγραφή γενετικού υλικού
Πρωτεΐνη Cdt1
Γονιδιωματική αστάθεια
Υπεριώδης ακτινοβολία
Keywords (translated): CRL4Cdt2
Cdt1
NHEJ
UVC
HR
IRIFs
Foci
FRAP
ImageJ macro
Abstract: Η χωροχρονική ρύθμιση της αντιγραφής του γενετικού υλικού εξασφαλίζεται με την αδειοδότησης των αφετηριών της αντιγραφής κατά τη G1 φάση του κυτταρικού κύκλου. Στα ευκαρυωτικά κύτταρα, η πρωτεΐνη Cdt1 καθορίζει πότε θα λάβει χώρα η αδειοδότηση και η έκφρασή της είναι αυστηρώς ρυθμισμένη μέσω πολλαπλών μονοπατιών. Διατάραξη αυτών των μηχανισμών δύναται να οδηγήσει σε γονιδιωματική αστάθεια, ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό ή σε κυτταρικό θάνατο. Γονιδιωματική αστάθεια σε ένα οργανισμό μπορεί να προκληθεί από βλάβες στο γενετικό υλικό, είτε εξαιτίας περιβαλλοντικών παραγόντων, είτε εξαιτίας τυχαίων αλλαγών από παραπροϊόντα του μεταβολισμού ή λάθη κατά την αντιγραφή. Για την αντιμετώπιση των διαφόρων βλαβών έχουν επιλεγεί εξελικτικά επιδιορθωτικοί μηχανισμοί εξειδικευμένοι στην αντιμετώπιση κάθε τύπου βλάβης. Η πρωτεΐνη Cdt1 φαίνεται να διασυνδέει τα μονοπάτια της αδειοδότησης της αντιγραφής με αυτά της απόκρισης σε βλάβη στο DNA, υπογραμμίζοντας τον κεντρικό ρόλο για τη διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Παρά το γεγονός ότι ο ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης είναι άγνωστος, το τρέχον μοντέλο ρύθμισης του Cdt1 βάση in vitro πειραμάτων σε πρωτεϊνικά εκχυλίσματα αυγών Xenopus υποστηρίζει ότι το Cdt1 αρχικά προσδένεται στην περιοχή της βλάβης μέσω αλληλεπίδρασης με το PCNA. Ακολούθως, το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω του Cdt1 και το στοχεύει για πρωτεόλυση. Στο πρώτο μέρος της μελέτης μελετήθηκαν οι αλληλεπιδράσεις των μερών του συμπλόκου PCNA-Cdt1-Cdt2 οι οποίες λαμβάνουν χώρα ύστερα από βλάβη από υπεριώδη ακτινοβολία σε ανθρώπινα καρκινικά κύτταρα με τη χρήση λειτουργικής μικροσκοπίας. Κατόπιν εφαρμογής εντοπισμένης υπεριώδους ακτινοβολίας, το PCNA στρατολογείται ταχέα και δεσμεύεται ισχυρά με τη χρωματίνη στη περιοχή της βλάβης. Σε αντίθεση με το τρέχον μοντέλο, αποδεικνύεται ότι το Cdt2 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης ανεξάρτητα από το Cdt1 και διατηρεί μακροχρόνιες αλληλεπιδράσεις με τη χρωματίνη. Η δέσμευση του Cdt2 στην περιοχή της βλάβης γίνεται με άμεση αλληλεπίδρασης με το PCNA μέσω μοτίβου αλληλεπίδρασης με το PCNA (PiP-box) που φέρει στην καρβοξυτελική περιοχή του. Το Cdt1 στρατολογείται στην περιοχή της βλάβης μέσω PiP-box στο αμινοτελικό άκρο και σταθεροποιείται στην περιοχή της βλάβης διαμέσου άμεσης αλληλεπίδρασης με το Cdt2. Επίσης, μελετήθηκε η επίδραση φωσφορυλίωσης από την ΑΤΜ/ATR κινάση. Δείξαμε ότι η φωσφορυλίωση του Cdt2 από την ΑΤΜ/ATR, αναστέλλει τη σταθεροποίηση του Cdt1 στη περιοχή της βλάβης. Στο δεύτερο μέρος της μελέτης ερευνάται ο ρόλος του Cdt1 στην περιοχή της βλάβης και η πιθανή εμπλοκή του στην επιλογή κατάλληλου επιδιορθωτικού μηχανισμού. Τα πειράματα που περιγράφονται μελετούν διπλές θραύσεις οι οποίες έγιναν είτε με χρήση ακτίνων X είτε με την χρήση παλμικού UVA laser 355nm σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές. Στην παρούσα μελέτη ότι η απουσία του Cdt1 δείξαμε να αυξάνει τον ρυθμό συγκέντρωσης των TLS πολυμερασών polκ και polη στην περιοχή της βλάβης παίζοντας ρόλο στη χρονική ρύθμιση της επιδιόρθωσης. Επίσης, πειράματα που έγιναν με ημιαυτόματους αλγόριθμους επεξεργασίας και ανάλυσης εικόνας, βρέθηκε ότι η απουσία του Cdt1 επηρεάζει αρνητικά την συγκέντρωση παραγόντων επιδιόρθωσης διπλών θραύσεων μέσω μη ομόλογης συνένωσης των άκρων (NHEJ) και συγκεκριμένα των 53BP1 και Rif1 σε ανθρώπινες καρκινικές σειρές μαστού (MCF7) και τραχήλου (HeLa kyoto). Αντίθετα, δεν φαίνεται να επηρεάζεται σημαντικά η συσσώρευση παραγόντων που εμπλέκονται στην έναρξη του ομόλογου ανασυνδυασμού όπως το BRCA1. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ένα σημαντικό ρόλο του παράγοντα Cdt1 στην επιλογη μονοπατιού επιδιόρθωσης βλάβης στο DNA. Στο τρίτο μέρος της μελέτης παρουσιάζονται αναλυτικές μέθοδοι ποσοτικοποίησης και ποιοτικής ανάλυσης που αναπτύχθηκαν για την μελέτη τόσο της πρωτεϊνικής κινητικής στρατολόγησης σε ζωντανά κύτταρα (recruitment-timelapse) αλλά και για την ημι-αυτοματοποιημένη μέτρηση εστιών σε υποπυρηνικές περιοχές και τη ποσοτικοποίηση πυρηνικών πρωτεΐνών σε διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου. Τέλος θα περιγραφούν αλγόριθμοι προεπεξεργασίας εικόνας για μετρήσεις αποστάσεων και όγκων.
Abstract (translated): The spatiotemporal regulation of DNA replication is safeguarded via a process called DNA replication licensing. In metazoa, the evolutionarily conserved protein Cdt1 is the key factor ensuring the timely licensing. Cdt1 is tightly regulated through various pathways, and its misregulation is linked to genomic instability, uncontrolled replication, apoptosis and carcinogenesis. Genomic instability may also occur following DNA damage, either due to environmental factors, or due to random mutations occurring through replication errors or metabolic byproducts. Evolution has equipped cells with various DNA damage response mechanisms for specific kinds of damage. The cell cycle regulatory protein Cdt1 has been postulated to interlink cell cycle and DNA damage responses, underscoring its crucial role for the maintenance of genome integrity. The exact role of Cdt1 at sites of damage remains a puzzle. The current regulation model of Cdt1 is based on in vitro experiments in Xenopus egg extracts. This model postulates that upon DNA damage, PCNA is loaded onto chromatin and then Cdt1 associates with PCNA through its N-terminal PCNA interacting motif (PIP-box). Cdt1 then interacts with the WD regions of Cdt2. It is therefore recruited to chromatin via direct interactions with Cdt1 and targets Cdt1 for ubiquitilation. At the first part of this study we aim to unravel the protein-protein interaction cascade regulating Cdt1 proteolysis after ultraviolet (UVC) induced DNA damage in human cancer cells by employing functional microscopy techniques. We know that following localised UVC irradiation, PCNA is recruited rapidly at sites of damage and binds onto the chromatin robustly, serving as a scaffold for repairing complexes. In contrast with the current model, Cdt2 is shown to be recruited at sites of damage independently from its substrates and maintains long-term interactions, regulating proteins that participate in the DNA damage response. It is recruited via direct interactions with PCNA through a newly found C-terminal PiP box. Moreover, it is shown that binding of Cdt1 to sites of damage is stabilised by interactions with Cdt2. Lastly, ATR-dependent phosphorylation of Cdt2 inhibits stabilisation of Cdt1 onto damage chromatin, thereby fine-tuning Cdt1 regulation. On the second part of this study, we try to shed light on the exact role of Cdt1 at sites of DNA damage and its involvment in the choice of DNA damage repair pathways, in particular Non-Homologous end Joining (NHEJ) and Homologous Recombination (HR). DNA double strand breaks (DSBs) were induced either with the use of X-ray irradiation or with a UVA pulsed laser (355nm) nanosurgery system in human breast (MCF7) and cervical (HeLa kyoto) cancer cells. The current study showed that the absence of Cdt1 enhances the recruitment of TLS polymerases (polκ and polη) onto PCNA and damaged sites. In addition, we know that Cdt1 absence impairs the formation of 53BP1 and RIF1 irradiation induced foci (IRIF) at sites of X-ray-induced DSBs, while it does not significantly affect BRCA1 recruitment. Our finding suggest a direct involvement of Cdt1 in the choice of repair pathways acting during the G1 phase of the cell cycle. At the third part of the study, we present methods for semi-automatic quantitative and qualitative image analysis that were developed with the use of ImageJ and Fiji. These macros were used to quantify the recruitment kinetics at sites of damage of proteins, quantify in a high-throughout manner the metrics (number, intensity, volume and position) of IRIFs in unsychronized cells and classify them by cell cycle phase. Also, macros for image preprocessing (background subtraction and segmentation), genomic content calculation and subnuclear distances in 3D space were implemented.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Nemertes_Giakoumakis(med).pdf19.19 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.