Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/3643
Title: Βιοχημικός και δομικός χαρακτηρισμός του τμήματος TPR επαναλήψεων του μεταγραφικού παράγοντα Ssn6 του Saccharomyces cerevisiae
Authors: Τάρτας, Θανάσης
Issue Date: 2010-09-07T06:16:11Z
Keywords: Saccharomyces cerevisiae
Πεπτίδια
Σύνθεση
Πρωτεΐνες
Keywords (translated): Saccharomyces cerevisiae
Peptids
Synthesis
Proteins
Abstract: Τα TPRs (Tetratricopeptide Repeats) είναι πρωτεϊνικά μοτίβα επαναλήψεων με μήκος πεπτιδικής αλυσίδας 34 αμινοξικών κατάλοιπων. Περισσότερα από 10000 TPRs έχουν εντοπι-στεί έως σήμερα σε διάφορες πρωτεϊνες, από τα αρχαιοβακτήρια έως τον άνθρωπο. Τα TPRs συμμετέχουν σε πρωτεϊνικές αλληλεπιδράσεις. Δομικά, κάθε TPR παρουσιάζει τη διαμόρφωση έλικα-στροφή-έλικα σε σχήμα φουρκέτας ενώ διαδοχικά πακεταρισμένα TPRs σχηματίζουν στο χώρο δεξιόστροφη υπερέλικα, στην οποία διακρίνονται μία κυρτή και μία κοίλη επιφάνεια. Το σύμπλοκο πρωτεϊνών Ssn6-Tup1 είναι ένας γενικός συγκαταστολέας της μεταγραφής στη ζύμη. Ομόλογα σύμπλοκα έχουν επίσης βρεθεί σε πολλούς οργανισμούς. Η πρωτεϊνη Ssn6 περιέχει δέκα διαδοχικά TPRs. Η αλληλεπίδραση των δύο πρωτεϊνών πραγματοποιείται μέσω των τριών πρώτων TPRs της Ssn6 και του Ν-τελικού τμήματος (αμινοξικά κατάλοιπα: 1-72) της Tup1. Σε προηγούμενη εργασία της η ερευνητική μας ομάδα έδειξε με πειράματα μεταλλαξιγένεσης και με δομική μοντελοποίηση, ότι η δομική ακεραιότητα του TPR 1 και η σωστή τοποθέτησή του σε σχέση με το TPR 2 είναι κρίσιμες για τη δέσμευση της Tup1. Στην παρούσα διατριβή διερευνήθηκε για πρώτη φορά η δομική σταθερότητα του τμήμα-τος της πρωτεϊνης Ssn6 που αλληλεπιδρά με την Tup1, και η σημασία που έχει για την αλληλε-πίδραση το Ν-τελικό άκρο της Ssn6, το οποίο περιλαμβάνει μία εκτεταμένη περιοχή πολυγλου-ταμίνης. Για τη μελέτη εφαρμόστηκαν χαρτογράφηση της πρωτεϊνης Ssn6 με περιορισμένη πρωτεόλυση καθώς και βιοχημικός χαρακτηρισμός και φασματοσκοπία κυκλικού διχρωισμού σε επιλεγμένα τμήματα των πρωτεϊνών Ssn6 και Tup1 και στα σύμπλοκά τους. Επιπρόσθετα πραγματοποιήθηκαν, in silico, σύγκριση των TPRs της Ssn6 με άλλα γνωστά TPRs, προβλέψεις της δομικής αστάθειας των TPRs και προσομοίωση μοριακής δυναμικής στο δομικό μοντέλο των TPRs 1-3. Ο συνδυασμός των παραπάνω έδειξε πως όταν απουσίαζει η Tup1 τα TPRs 1 και 2 της Ssn6 βρίσκονται μερικώς αδίπλωτα. Ειδικά η έλικα Β του TPR1 φαίνεται ότι είναι ιδιαίτερα ευκίνητη και ότι εκθέτει μία έντονα υδρόφοβη επιφάνεια στο περιβάλλον μέσo του μορίου. Αντίθετα, όταν τα ίδια τμήματα της Ssn6 συμμετέχουν σε σύμπλοκα με την Tup1 παρουσιά-ζουν την αναμενόμενη δευτεροταγή διαμόρφωση δομικού τμήματος TPR. Παράλληλα, υπάρ-χουν ισχυρές ενδείξεις ότι η μετάβαση από την κατάσταση του τυχαίου σπειράματος προς τη διαμόρφωση α-έλικας συνοδεύεται από τη διευθέτηση των α-ελίκων σε δεμάτια. Τέλος, η παρουσία του Ν-τελικού άκρου της Ssn6 εμποδίζει τη συσσωμάτωση του τμήματος που αποτε-λείται από τα TPRs 1-4 όταν απουσιάζει η Tup1. Με βάση τα παραπάνω αποτελέσματα της εργασίας προτείνεται ότι η Ssn6 ανήκει στις φυσικές μερικώς αδίπλωτες πρωτεϊνες. Η έλλειψη δομικής διαμόρφωσης και η δομική ευκαμψία στο TPR1 της πρωτεΐνης εξυπηρετεί την αναγνώριση της πρωτεϊνης Tup1. Ο σχηματισμός συμπλόκου με την πρωτεΐνη Tup1 οδηγεί σε δίπλωμα τα TPRs 1 και 2, σε αντιστοιχία με το μοντέλο συζευγμένου διπλώματος και σύνδεσης του προσδέματος που έχει παρατηρηθεί σε άλλες πρωτεϊνες. Ο σχηματισμός του συμπλόκου πραγματοποιείται με υδρόφοβες αλληλεπι-δράσεις μεταξύ των δύο πρωτεϊνών και από την πλευρά της Ssn6 συμμετέχει κατά κύριο λόγο η κυρτή επιφάνεια της TPR-υπερέλικας. Τα δύο τελευταία συμπεράσματα αναδεικνύουν ένα νέο μηχανισμό TPR-αλληλεπιδρά-σεων, ο οποίος δεν είχε αναγνωριστεί έως τώρα στα TPR-πρωτεϊνικά σύμπλοκα.
Abstract (translated): The tetratrico peptide repeat (TPR) is a 34 amino acid protein motif. Over 10000 TPRs have been identified in several species from archeobacteria to human. TPRs are protein-protein interaction mediators. Each TPR adopts a helix-turn-helix conformation in the form of α hairpin. Tandem TPRs stack together producing a right handed curved superhelix, with a convex and a concave surface. The Ssn6-Tup1 protein complex is a general transcriptional co-repressor in yeast. Homologous complexes have been identified in many organisms. The Ssn6 protein contains 10 tandem TPRs. TPRs 1-3 interact with the N-terminus (aa: 1-72) of Tup1 to form the complex. Using 3D-modeling and mutagenesis data, our group has previously shown that the structural integrity of TPR 1 and its correct positioning relatively to TPR 2 are crucial for Tup1 binding. In the present study we investigate the structural stability of the Tup1-binding domain of Ssn6 and the importance of the Ssn6 N-terminus, which contains a polyglutamine sequence. For the purpose of the study we used limited proteolysis mapping of Ssn6 and biochemical characterization and circular dichroism spectroscopy of specific Ssn6 and Tup1 segments and their complexes, followed by order/disorder predictions and molecular dynamics simulations. Our data suggest that TPRs 1 and 2 of Ssn6 are partially unfolded with the helix B of TPR 1 being highly dynamic, exposing an apolar surface to the solvent. However, TPRs 1-3 seem to adopt the TPR-typically expected secondary structure when the Ssn6 segment is in association with Tup1. In addition there are strong evidence that a conformational change occurs upon complex formation, consisting of acquisition of a-helical structure with simultaneous stabilization of coiled coil configuration. The presence of the Ssn6 N-terminus prevents the aggregation of the TPR 1-4 segment in the absence of Tup1. According to the above we propose that: Ssn6 is a member of the partially unfolded proteins group. The lack of typical conformation and the structural flexibility of TPR 1 serve the Tup1 recognition and binding. Complex formation followed by TPR 1 and 2 folding is consistent with the coupled folding to binding mechanism, reported on other binding proteins. The Ssn6-Tup1 complex formation is driven by hydrophobic interactions, in which mainly the convex surface of the TPR-superhelix takes part. The later two points reveal a novel interaction mechanism of the TPR motives.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Nimertis_Tartas(chem).pdfΚυρίως κείμενο4.63 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.