Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/9362
Title: Μελέτη της επίδρασης του χημικού αναστολέα DZNep σε λευχαιμικά κύτταρα K562 για τη διερεύνηση του ρόλου της Geminin στην σύσταση του συμπλόκου Polycomb Respressive Complex 2 (PRC2)
Other Titles: A study of the effect of chemical inhibitor DZNep on K562 leukemic cells in order to investigate the role of Geminin in the composition of the Polycomb Repressive Complex (PRC2)
Authors: Νόρα, Γεωργία-Ιωάννα
Keywords: Καρκίνος
Αναστολέας DZNep
Κύτταρα Κ562
Χρόνια μυελογενής λευχαιμία
Κατασταλτικά σύμπλοκα Polycomb 2
Γονίδια HOXA9
Keywords (translated): Cancer
DZNep inhibitor
Geminin
K562 cells
Chronic myeloid leukemia
Polycomb repressive complex 2
ΗΟΧΑ9 genes
Abstract: Στους ανώτερους ευκαρυωτικούς οργανισμούς η ανάπτυξη των φυσιολογικών κυττάρων καθορίζεται και ελέγχεται αυστηρά από συγκεκριμένους μηχανισμούς. Διατάραξη ή απώλεια των μηχανισμών αυτών οδηγεί στη δημιουργία καρκινικών κυττάρων με κύρια χαρακτηριστικά τον ανεξέλεγκτο πολλαπλασιασμό και την ικανότητα εξάπλωσης τους σε άλλους ιστούς. Η Geminin είναι μία πρωτεΐνη με διττό ρόλο καθώς εμπλέκεται τόσο στη διαδικασία διαφοροποίησης των κυττάρων όσο και στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου. Συμβάλλει στη διασφάλιση της γονιδιωματικής σταθερότητας αποτρέποντας την πραγματοποίηση του διπλασιασμού του DNA περισσότερες από μία φορές σε κάθε κύκλο, μέσω της αλληλεπίδρασής της με τον παράγοντα Cdt1. Ταυτόχρονα, η Geminin ρυθμίζει την κυτταρική διαφοροποίηση καθώς αλληλεπιδρά με μεταγραφικούς παράγοντες και σύμπλοκα αναδιαμόρφωσης της χρωματίνης. Ένα τέτοιο σύμπλοκο είναι και το Polycomb 2 (PRC2), με το οποίο φαίνεται να δρα συνεργατικά, συμβάλλοντας στη ρύθμιση της κατασταλτικής του δράσης. Η χημική ένωση 3-deazaneplanοcin A (3-από(δε)αζανεπλανοσινη Α) (DZNep) είναι αναστολέας της Ν-μεθυλτρανφεράσης (ΕΖΗ2), η οποία είναι κατεξοχήν καταλυτική υπομονάδα του PRC2. Είναι υπεύθυνη για την τριμεθυλίωση της λυσίνης 27 στην ιστόνη Η3, που διατηρεί τα γονίδια στόχους σε μια ανενεργό κατάσταση. Χορήγησή του αναστολέα σε λευχαιμικά κύτταρα οδηγεί στην μείωση της έκφρασης της ΕΖΗ2 και στην αύξηση της έκφρασης του λευχαιμιογόνου γονιδίου HOXA9 που ρυθμίζεται από το σύμπλοκο. Επιπλέον επάγει την απόπτωση καρκινικών κυττάρων και αναστέλλει την ανάπτυξη της καλλιέργειάς τους in vitro. Στη παρούσα διπλωματική εργασία μελετήθηκε η επίδραση του χημικού αναστολέα DZNep στην ανάπτυξη λευχαιμικών κυττάρων. Επιπλέον εξετάσθηκε η ανάπτυξη των διαμολυσμένων με shRNA κυττάρων, για την σίγαση της Geminin. Τέλος ερευνήθηκε το αποτέλεσμα της συνδυαστικής δράσης του χημικού αναστολέα και της αποσιώπησης της Geminin στην ανάπτυξη της καλλιέργειας καρκινικών κυττάρων καθώς και στην έκφραση του γονιδίου HOXA9. Συγκεκριμένα για τη διερεύνηση των παραπάνω ερωτημάτων χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα της σειράς Κ562. Τα κύτταρα καλλιεργήθηκαν σε θρεπτικό μέσο στο οποίο είχε προστεθεί o αναστολέας DZNep σε διάφορες συγκεντρώσεις και ακολούθησε καταμέτρησή τους σε διαφορετικά χρονικα διαστήματα. Επιπλέον, μελετήθηκε η ανάπτυξη κυττάρων Κ562 διαμολυσμένων με shRNA για τη σίγαση του γονιδίου της Geminin, σε σύγκριση με αυτή των κυττάρων που εκφράζουν το γονιδιο. Τέλος, έγινε συνδυασμός των δύο παραπάνω για να μελετηθεί η δράση της σίγασης της Geminin ταυτόχρονα με χορήγηση του DZNep σε Κ562. Λήφθηκαν δείγματα κυττάρων από κάθε συνθήκη και ποσοτικοποιήθηκε η έκφραση του γονιδίου της Geminin αλλά και του HOXA9 με Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης Πραγματικού Χρόνου (Real Time PCR). Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν μείωση του ρυθμού πολλαπλασιασμού των κυττάρων στα οποία είχε χορηγηθεί ο DZNep, ανάλογη με την συγκέντρωση του αναστολέα στην καλλιέργεια. Επίσης, παρατηρήθηκε αυξηση της ανάπτυξης των κυττάρων με την αποσιώπηση της Geminin. Τέλος, παρατηρήθηκε μείωση του ρυθμού ανάπτυξης των διαμολυσμένων με shRNA κυττάρων με την προσθήκη του DZNep, αντίστοιχη με αυτή που παρουσιάστηκε στα κύτταρα που εκφράζουν τη Geminin. Συμπερασματικά, η παρουσία ή απουσία της Geminin δεν επηρεάζει τη δράση του αναστολέα ο οποίος επιβραδύνει την ανάπτυξη των λευχαιμικών κυττάρων in vitro. Από την αντίδραση PCR πραγματικού χρόνου προέκυψε ότι: 1) η έκφραση του HOXA9 είναι αμελητέα στα Κ562 κύτταρα, υπο φυσιολογικές συνθήκες, ενώ αυξάνεται σημαντικά με την in vitro απαλοιφή της Geminin, 2) η έκφραση του γονιδίου αυξάνεται ακόμα περισσότερο μετά τη χορήγηση του αναστολέα DZNep. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδεικνύουν από τη μία την αντιλευχαιμική δράση του αναστολέα και από την άλλη την πιθανή συνεργατική δράση της σίγασης της Geminin και του DZNep στην ρύθμιση της έκφρασης γονιδίων.
Abstract (translated): In higher eukaryotes the growth of normal cells is defined and strictly controlled by specific regulatory mechanisms. Disruption or loss of these mechanisms leads to carcinogenesis characterized by the unregulated proliferation of cells and their capacity to spread to other tissues. Geminin is a bifunctional protein involved both in cell proliferation and differentiation. It maintains genomic stability by preventing DNA replication to take place more than once in each cell cycle, through its interaction with the factor Cdt1. Simultaneously, Geminin regulates cell differentiation by interacting with transcription factors and chromatin remodeling complexes. One such complex is Polycomb 2 (PRC2), with which it acts synergistically contributing to the regulation of its suppressor activity. The chemical compound 3-deazaneplanocin A (DZNep) is an inhibitor of the N-methyltranferase EZH2, which is the predominant catalytic subunit of PRC2. It is responsible for the trimethylation of lysine 27 on histone H3 that suppresses transcriptional activation. Administration of the inhibitor in leukemic cells leads to downregulation of EZH2 and overexpression of the leukemogenic gene HOXA9, which is regulated by the complex. It also induces apoptosis in cancer cells and inhibits cellular growth in vitro. In the present dissertation we studied the effect of chemical inhibitor DZNep in leukemic cell growth. Furthermore, we examined the growth of cells transfected with shRNA, to silence Geminin. Finally, we investigated the effect of the combined action of the chemical inhibitor with the silencing of Geminin, on a cancer cell culture and on HOXA9 expression. For the investigation of the above queries K562 cells were used. Cells were cultured in medium, supplemented with the DZNep inhibitor at various concentrations, and subsequently the number of cells were counted. In addition, K562 cells transfected with shRNA for Geminin silencing were obtained and their growth was studied in comparison to that of cells expressing the gene. Finally, there was a combination of these two to study the effect of Geminin silencing and DZNep administration in K562 cells, simultaneously. Cell samples were gathered from each condition and Geminin and HOXA9 expression was quantified with Real Time Polymerase Chain Reaction (Real Time PCR). The results indicated a reduction in the proliferation rate of cells that were treated with DZNep, which was proportional to the concentration of the inhibitor in the culture. Moreover, an increase in cell growth upon Geminin silencing was observed. Finally, there was a reduction in the growth rate of the shRNA expressing cells after DZNep treatment, corresponding to that observed in cells that express Geminin. In conclusion, the presence or absence of Geminin does not affect the activity of the inhibitor that prevents leukemia cell growth in vitro. Real-time PCR analysis showed that: 1) The expression of HOXA9 is normally negligible in wild-type K562 cells, while it increases significantly upon Geminin silencing. 2) HOXA9 expression was further increased after the administration of DZNep. These results indicate the antileukemic activity of the inhibitor and on the other hand, the possible synergistic effect of Geminin silencing and DZNep, on the regulation of gene expression
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
-DISSERTATION - 3.pdfΚυρίως Άρθρο2.08 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.