Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/9524
Title: Δημιουργία τράπεζας πληροφοριών Ελλήνων παρκινσονικών και εύρεση νέων και γνωστών μεταλλάξεων του γονιδίου NR4A2 και η λειτουργική τους σημασία
Other Titles: Creation of biobank of Greek Parkinsonian patients and discovery of new and known mutations of NR4A2 gene and their functional role
Authors: Ζιαβρά, Δέσποινα
Keywords: Νόσος του Πάρκινσον
Μετάλλαξη
Τράπεζα δεδομένων
Keywords (translated): NR4A2
Parkinson disease
Mutation
Biobank
Abstract: Η νόσος του Πάρκινσον (ΝΠ) είναι μια χρόνια, προοδευτική νευροεκφυλιστική νόσος του Κεντρικού Νευρικού Συστήματος (ΚΝΣ). Τα πρωτογενή συμπτώματα της ΝΠ είναι ο τρόμος, η βραδυκινησία, η ακαμψία και η αστάθεια θέσης, που μαζί με την απόκριση του ασθενούς στην αγωγή της levodopa (L-dopa) αποτελούν και μέρος της κλινικής διάγνωσης της νόσου. Η χαρακτηριστική παθοφυσιολογία της ΝΠ, στην οποία στηρίζεται και η οριστική διάγνωση της νόσου, συνίσταται στην εκφύλιση των ντοπαμινεργικών νευρώνων της SNpc που συνοδεύεται από την εμφάνιση ενδοκυτταρικών πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων, των σωματίων Lewy. Ολοένα και αυξανόμενα δεδομένα καταδεικνύουν ότι πολλές περιπτώσεις της νόσου Πάρκινσον προκαλούνται από γενετικές ανωμαλίες ή από απροσδιόριστες περιβαλλοντικές προσβολές που ενεργούν στα γενετικά προδιαθεμένα άτομα. Μέσα σε αυτά τα γονίδια που ενοχοποιούνται για την εμφάνιση της νόσου είναι και το γονίδιο Nurr1 (NR4A2). Το Nurr1 ανήκει στην υπο-οικογένεια NGFI-B (Nerve Growth Factor-Induced clone B) των ορφανών υποδοχέων. Εκφράζεται στους πυρήνες των κυττάρων του κεντρικού νευρικού συστήματος, και ιδιαίτερα στους ντοπαμινεργικούς νευρώνες. Είναι σημαντικό μόριο για την ανάπτυξη καθώς και στην επιβίωση των ντοπαμινεργικών νευρώνων. Σε εγκεφάλους Παρκινσονικών ασθενών έχει διαπιστωθεί σημαντικά μειωμένη έκφραση του Nurr1 ειδικά στους νευρώνες της μέλαινας ουσίας με έγκλειστα α-συνουκλεΐνης ενώ έχουν εντοπιστεί και 5 διαφορετικές μεταλλάξεις σε ασθενείς της νόσου. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η δημιουργία Τράπεζας Δεδομένων Ελλήνων Παρκισονικών και ο εντοπισμός νέων ή των ήδη γνωστών μεταλλάξεων του γονιδίου του Nurr1 στον ελληνικό πληθυσμό καθώς και η λειτουργική ανάλυση των νέων αλλά και παλιών μεταλλάξεων και προσδιορισμός του μηχανισμού με τον οποίο οι μεταλλάξεις αυτές επηρεάζουν τα επίπεδα συγκέντρωσης mRNA του Nurr1. Για τη δημιουργία τράπεζας πληροφοριών Ελλήνων Παρκινσονικών βασιστήκαμε αρχικά στις ήδη υπάρχουσες συλλογές δειγμάτων DNA και ιατρικών ιστορικών που έχουν συλλέξει η Δρ. Αθανασιάδου και ο Δρ. Χατζηγεωργίου. Αυτές οι συλλογές επαυξήθηκαν από επιπλέον δείγματα με πλήρη ιστορικά που συλλέχθηκαν από την Αθήνα (Αττικό Νοσοκομείο) (Δρ Στεφανής) καθώς και τις Κυκλάδες (Δρ.Μπόζη). Από την ανάλυση των δειγματών DNA που είχαν απομονωθεί από ασθενείς και μάρτυρες της Τράπεζας με τη μέθοδο SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) ανακαλύφθηκε μια καινούργια μετάλλαξη στο πρώτο εξώνιο (θέση που εντοπίζονται οι 4 από τις 5 γνωστές μεταλλάξεις του Nurr1) στη θέση -339 ενώ δεν εντοπίστηκαν στον υπό εξέταση πληθυσμό καμία από της ήδη 5 γνωστές μεταλλάξεις. Μελέτη των επιπέδων έκφρασης του Nurr1 με qPCR στα λεμφοκύτταρα του ασθενούς που φέρει την μετάλλαξη σε σύγκριση με τους υγιείς συγγενείς του (αδέρφια) δεν έδειξε να υπάρχει καμία αξιόλογη μεταβολή στα επίπεδα έκφρασης του Nurr1 μεταξύ των τριών δειγμάτων σε αντίθεση με μεταλλάξεις το γονιδίου αυτού σε άλλες θέσεις του εξωνίου 1. Για την μελέτη των επιπτώσεων της μετάλλαξης -339 στη λειτουργία του Nurr1 επιμολύναμε νευροβλαστικά κύτταρα SHSY-5Y με πλασμίδια που έφεραν τις μεταλλάξεις -339 καθώς και τις ηδη γνωστές μεταλλάξεις (-291,-245,-223,-253) σε γενομικούς και cDNA κλώνους του Nurr1 και μετρήσαμε τα επίπεδα της παραγόμενης λουσιφεράσης. Διαπιστώσαμε ότι όλες οι μεταλλάξεις επέφεραν μείωση των επιπέδων της λουσιφεράσης κατά περίπου δύο τρίτα σε σχέση με τον γενομικό κλώνο που έφερε το άγριου τύπου Nurr1. Τα αποτελέσματα αυτά έδειξαν για πρώτη φορά ότι η μετάλλαξη -339 όντως επηρεάζει την λειτουργία του Nurr1 και μάλιστα έχει την δυνατότητα να μεταβάλει τα επίπεδα ενεργοποίησης γονιδίων στόχων.
Abstract (translated): Parkinson’s Disease (PD) is a chronic, progressive neurodegenerative disease of the central nervous system. The primary symptoms of PD is tremor, bradykinesia, rigidity and postural instability. These symptoms combined with the response of patient to levodopa (L-dopa) compose a part of clinical diagnose of the disease. The characteristic pathophysiology of PD, in which the final diagnose is based, is the neurodegeneration of dopaminergic neurons of substantia nigra followed by the appearance of endocellular protein aggregations, the Lewy bodies. Rising data demonstrate that many cases of PD patients provoked by genetic abnormalities or by indeterminate environmental insults which influences the genetic predisposed cases. One of the genes that is implicated in the apparition of the disease is Nurr1 (NR4A2). Nurr1 gene belongs in the sub-family of NGFI-B (Nerve Growth Factor-Induced clone B) of orphan receptors. It is expressed in the nucleus of cells of central nervous system, and particularly in the dopaminergic neurons. It is an important molecule for the development and the survival of dopaminergic neurons. In the brain of parkinsonian patients Nurr1 expression is reduced, particularly in the neurons of substantia nigra which have aggregations of a-synuclein, while five different mutations of the gene have been identified in PD patients. The purpose of these work was the creation of a Biobank of Greek PD patients and the discovery of new or already known mutations of Nurr1 in the Greek population and their functional analysis as well as the identification of the mechanism with whom the mutations influences the levels of Nurr1 mRNA. In the beginning, for the creation of the Biobank we were based on the existing DNA and anamnesis of Dr. Athanasiadou and Dr. Hatzigeorgiou. These collections were compile with new samples and extended anamnesis from Attikon Hospital (Dr.Stefanis) and Cyclades (Dr. Bozi). From the analysis of DNA samples of control and patients of the Biobank with the SSCP (Single-Strand Conformation Polymorphism) method one new mutation of Nurr1 was discovered in the first exon of the gene in position -339 ( the exon where four from five known mutations are detected) , while no known mutation has been found. The study of the levels of Nurr1 expression with qPCR in the lymphocytes of the patient in comparison to his healthy family members showed no remarkable changes in the levels of Nurr1 expression of patient in contrast to what it happens with other mutations of the gene. For the study of the influence of mutation -339 in the function of Nurr1, neuroblastoma SHSY-5Y cells were transfected with plasmids which carry the mutation -339 or other known mutations of the gene (-291,-245,-223,-253) in genomic or cDNA clones of Nurr1 and we measured the levels of luciferase. We observed that all the mutations reduced the levels of luciferase about 2/3 in comparison to genomic clone that carries the wild type Nurr1. The results showed for the first time that indeed the mutation -339 influences the function of Nurr1.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Ziavra(med).pdf11.18 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.