Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/10149
Title: Σχεδιασμός και μελέτη αναστολέων των DEDD αποαδενυλασών με βάση τη προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της ριβονουκλεάσης PNLDC1
Other Titles: Design and study of inhibitors of DEDD deadenylases based on molecular dynamics simulation of the active site of ribonuclease PNLDC1
Authors: Σκεπαρνιάς, Ηλίας
Keywords: Αποαδενυλίωση
Κυτταρικός κύκλος
Αναστολείς αποαδενυλίωσης
Σχεδιασμός φαρμάκων
Αποαδενυλάσες
Κινητική ανάλυση
Κυτταρομετρία ροής
Προσομοίωση μοριακής δυναμικής
Ριβονουκλεάσες
Αγγελειοφόρο RNA
Έλεγχος ποιότητας RNA
Ανακύκλωση mRNA
Keywords (translated): Deadenylation
PARN
PNLDC1
PARN-Like
Cell cycle
Inhibitors of deadenylases
Drug design
Deadenylases
E-14
A549
MTT assay
FACS
Kinetic analysis
Virtual screening
Molecular dynamics simulations
Ribonucleases
mRNA
RNA quality control
mRNA turnover
Abstract: Η ακριβής ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης απαιτεί συνεχή έλεγχο της μοίρας των μορίων mRNA σχεδόν σε κάθε στάδιο του κύκλου ζωής τους. Η poly(Α) ουρά παίζει καθοριστικό ρόλο στην ωρίμανση των ευκαρυωτικών μορίων mRNA, και αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή για τον έλεγχο της μεταγραφής, την επεξεργασία, τον έλεγχο της ποιότητας, τη μεταφορά, τη μετάφραση, την αποσιώπηση και την αποικοδόμηση αυτών. Η βράχυνση της poly(Α) ουράς συνοδεύεται από την μεταφραστική σίγαση ή την αποικοδόμηση των μορίων mRNA και καταλύεται από ποικίλες αποαδενυλάσες που εμφανίζουν 3'-5' δράση εξωνουκλεάσης. Όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν είτε στην DEDD (το όνομά της προκύπτει από τα συντηρημένα αμινοξέα του ενεργού κέντρου των ενζύμων που ανήκουν σε αυτήν) ή στην exonuclease- endonuclease-phosphatase (EEP) υπεροικογένεια. Η πιο καλά μελετημένη, DEDD τύπου αποαδενυλάση, είναι η εξαρτώμενη από την καλύπτρα poly(Α)-εξειδικευμένη ριβονουκλεάση (PARN). Προηγούμενη εργασία από την ομάδα μας, έχει εντοπίσει ένα νέο ένζυμο με δράση αποαδενυλάσης που κωδικοποιείται από το pnldc1, ένα παράλογο γονίδιο του parn. Μελέτες σε έμβρυα ποντικού έδειξαν ότι η έκφραση του pnldc1 μπορούσε να ανιχνευθεί μόνο σε όρχεις και σε βλαστικά κύτταρα υποδεικνύοντας ένα πιθανό ρόλο κατά την ανάπτυξη. Επιπλέον, η έκφρασή του μειώνεται όσο τα κύτταρα διαφοροποιούνται. Οι μηχανισμοί πίσω από την ενεργοποίηση της αποαδενυλίωσης ρυθμίζονται αυστηρά και σχετίζονται με διάφορες κυτταρικές συνθήκες, όπως είναι η ανάπτυξη, η επιτήρηση μορίων mRNA, η απόκριση σε βλάβη στο γενετικό υλικό, η διαφοροποίηση των κυττάρων και ο καρκίνος. Επιπλέον, η αναστολή αυτών των ενζύμων έχει προταθεί ως μια νέα αντικαρκινική στρατηγική, με βάση το γεγονός ότι πολλαπλασιαζόμενα κύτταρα απαιτούν συνεχή παραγωγή και ανακύκλωση συγκεκριμένων μορίων mRNA κατά τη διάρκεια του κυτταρικού τους κύκλου. Σε αυτή τη μελέτη εντοπίσαμε νέες χημικές ενώσεις οι οποίες αναστέλλουν ειδικά DEDD τύπου αποαδενυλάσες και μελετήσαμε την επίδρασή τους σε καρκινικά και βλαστικά κύτταρα. Με βάση τη διαθέσιμη δομή της τροποποιημένης hPARN πραγματοποιήσαμε προσομοίωση μοριακής δυναμικής του ενεργού κέντρου της PNLDC1 ακολουθούμενη από υψηλής απόδοσης εικονικής διαλογής (high throughput virtual screening) η οποία επέτρεψε την επιλογή και το σχεδιασμό των εν δυνάμει αναστολέων για τις δύο αποαδενυλάσες. Αναλύθηκε in silico η βιβλιοθήκη των ενώσεων και ταυτοποιήθηκαν ισχυροί αναστολείς και για τα δύο ένζυμα των οποίων η δραστικότητα ελέγχθηκε τόσο in vitro όσο και in vivo. Πραγματοποιήθηκαν όλες οι κινητικές αναλύσεις αυτών των ενώσεων και υπολογίστηκαν οι IC50 τιμές τους in vitro. Είναι ενδιαφέρον ότι, η ένωση ASN_06816210 αναστέλλει ειδικά την PNLDC1, ενώ η ASN_14000976 ενεργοποιεί την PARN. Σε επόμενο βήμα, ελέγθηκε η κυτταρική βιωσιμότητα με την μέθοδο ΜΤΤ. Τέλος, ανάλυση του κυτταρικού κύκλου με κυτταρομετρία ροής έδειξε ότι οι ενώσεις αυτές προκαλούν αναστολή του κυτταρικού κύκλου σε Α549 και βλαστικά κύτταρα κατά τη φάση G0/G1. Οι συγκεντρώσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κάτω από αυτές των τοξικών επιπέδων των ενώσεων. Συνολικά, στην παρούσα μελέτη προτείνουμε ότι αυτές οι χημικές ενώσεις αλληλεπιδρούν με DEDD τύπου αποαδενυλάσες και επηρεάζουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό.
Abstract (translated): Accurate regulation of gene expression requires constant control of mRNAs fate in almost every stage of its lifecycle. The poly(A) tail plays a crucial role in mature eukaryotic mRNAs, providing widespread means of controlling transcription, processing, quality control, transport, translation, silence, and decay. Shortening of poly(A) tails is accompanied with translational silencing or mRNA degradation and is catalyzed by diverse deadenylases that exhibit 3’-5’ exonuclease activity. All known deadenylases belong to either the DEDD or the exonuclease–endonuclease–phosphatase (EEP) superfamilies. The most well studied DEDD type deadenylase is Poly(A)-specific Ribonuclease (PARN) which is a cap-interacting and poly(A)-specific 3’-exoribonuclease. Previous work from our group has identified a novel enzyme with deadenylase activity encoded by pnldc1, a parn paralog gene. Studies in mouse embryos showed that pnldc1 expression is detectable only in testis and placental stem cells indicating a possible role during development. Furthermore, its expression fades away along differentiation. The mechanisms underlying deadenylation activation are highly regulated and associated with cellular conditions such as development, mRNA surveillance, DNA damage response, cell differentiation and cancer. In addition, inhibition of these enzymes has been proposed as a novel anti-proliferative strategy, based on the fact that proliferating cells require constant production and turnover of specific mRNAs during the cell cycle. In this study, we identified novel chemical compounds that are able to inhibit DEDD deadenylases in a specific way and we studied their effects on cancer or stem cells. Based on the available structure of a truncated hPARN form we performed molecular dynamical simulations of the active site of PNLDC1 followed by high throughput virtual screening, which allowed the selection and design of putative modulators for both deadenylases. The compound library was analyzed in silico and verified both in vitro and in vivo after identification of strong inhibitors of both enzymes. We performed all the kinetic analyses of these compounds and the IC50 was assessed in vitro. Interestingly, the compound ASN_06816210 specifically inhibits PNLDC1, whereas ASN_14000976 activates PARN. In a next step, we have determin the cell viability by MTT method. Finally, cell cycle analysis by flow cytometry revealed that these compounds cause cell cycle arrest on A549 and stem cells at the G0/G1 phase. The concentrations that we used were below the toxic levels of the compounds. Overall, in this study we propose that these chemical compounds are able to interact with DEDD deadenylases and affect cell proliferation.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Skeparnias(med).pdf2.86 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons