Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/10718
Title: Ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA μέσω φωταυγειομετρικών τεχνικών ανάλυσης
Other Titles: Detection of specific DNA sequences through chemiluminometric analytical techniques
Authors: Κουνέλλη, Μαρία
Keywords: Νοθεία
Νοθεία γάλακτος
Μέθοδοι ανίχνευσης νοθείας
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)
Χημειοφωταύγεια
Φρεάτια μικροτιτλοδότησης
Κυτταρομετρία ροής
Μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου
Φθορισμός
Keywords (translated): Adulteration
Milk adulteration
Food adulteration
DNA
Polymerase Chain Reaction (PCR)
Chemiluminescence
Microtiter wells
Flow cytometry
Polystyrene microspheres
Fluorescence
Abstract: Οι νοθείες των τροφίμων και συγκεκριμένα οι νοθείες του γάλακτος και των γαλακτοκομικών προϊόντων με τις οποίες θα ασχοληθούμε στην παρούσα εργασία, θεωρούνται ως ένα από τα σημαντικότερα ζητήματα που καλείται να αντιμετωπίσει σήμερα το καταναλωτικό κοινό υπερασπιζόμενο το αναυθαίρετο δικαίωμα του για ακριβή γνώση της σύστασης των προϊόντων που εισέρχονται στο τραπέζι του. Τα τελευταία χρόνια, το δικαίωμα αυτό, κυρίως λόγω της αυξανόμενης ζήτησης αυτής της κατηγορίας τροφίμων, καθώς το γάλα και γενικότερα τα γαλακτοκομικά προϊόντα θωερούνται από τα πιο ωφέλιμα και απαραίτητα συστατικά μιας ισορροπημένης και υγειούς διατροφής, παραβιάζεται από τις βιομηχανίες παραγωγής και τις μονάδες επεξεργασίας τροφίμων με μόνο κίνητρο την αύξηση του κέρδους. Για αυτό το λόγο κρίνεται πλέον επιτακτική η ανάγκη ανάπτυξης γρήγορων, ευαίσθητων και αξιόπιστων αναλυτικών τεχνικών για την ανίχνευση της νοθείας του γάλακτος. Στην παρούσα διπλωματική εργασία αναπτύσσονται δύο μέθοδοι, μια χημειοφωταυγειομετρική και μία φθορισμομετρική, για την ανίχνευση των διαφόρων ειδών γάλακτος. Και οι δύο αυτές μέθοδοι βασίζονται στην ανίχνευση ειδικών αλληλουχιών DNA των τριών βασικών ειδών γάλακτος, δηλ. πρόβειου, αγελαδινού και κατσικίσιου, τόσο όταν αυτά βρίσκονται μεμονωμένα, όσο και υπό τη μορφή μιγμάτων μεταξύ τους. Η πρόκληση των τεχνικών αυτών είναι η ανίχνευση εξαιρετικά μικρών συγεντρώσεων συγκεκριμένων αλληλουχιών νουκλεϊκών οξέων ανάμεσα σε ένα πολύ μεγάλο αριθμό διαφορετικών αλληλουχιών ολόκληρου του γενωμικού υλικού. Πρωταρχικό στάδιο και των δύο μεθόδων είναι ο in vitro πολλαπλασιασμός συγκεκριμένης προς ανάλυση αλληλουχίας DNA με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction). Η πρώτη μέθοδος η οποία αναπτύχθηκε είναι μία χημειοφωταυγειομετρική μέθοδος ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων μέσω δοκιμασιών υβριδοποίησης, σε φρεάτια μικροτιτλοδότησης δηλ. σε διακριτές επιφάνειες πολυστυρενίου. Η δοκιμασία αυτή βασίζεται στη συμπληρωματικότητα μεταξύ των βάσεων του DNA, στην εκλεκτική αντίδραση μεταξύ ενζύμου-υποστρώματος ή αντιγόνου-αντισώματος και στην εκπομπή χημειοφωταύγειας. Τα προϊόντα PCR που χρησιμοποιούνται στη δοκιμασία είναι κατάλληλα επισημασμένα, ώστε να καθίσταται δυνατή η ανίχνευση τους, ενώ η ένταση της παραγόμενης χημειοφωταύγειας είναι ανάλογη της συγκέντρωσης της ειδικής αλληλουχίας-στόχου. Η μέθοδος εφαρμόστηκε επιτυχώς στην ανίχνευση και των τριών ειδών γάλακτος με όριο ανίχνευσης ίσο με 1,4 pM. Επιπλέον, με σκοπό τον έλεγχο νοθείας πραγματοποιήθηκε ανίχνευση προσμίξεων αγελαδινού γάλακτος σε πρόβειο και κατσικίσιο σε χαμηλό ποσοστό ίσο με 0,01%. Η δεύτερη μέθοδος την οποία αναπτύξαμε είναι μια φθορισμομετρική μέθοδος ανίχνευσης νουκλεϊκών οξέων, μέσω δοκιμασιών υβριδοποίησης σε εναιώρημα φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου στο εσωτερικό των οποίων περιέχονται δύο φθορίζουσες χρωστικές σε συγκεκριμένη αναλογία, έτσι ώστε κάθε σφαιρίδιο να είναι μοναδικό. Τα βασικά στάδια της μεθόδου αυτής είναι η ομοιοπολική πρόσδεση ειδικών ολιγονουκλεοτιδίων-ανιχνευτών στην επιφάνεια των μικροσφαιριδίων και η υβριδοποιήση τους με τις αντίστοιχες αλληλουχίες DNA-στόχους. Τα υβρίδια που προκύπτουν ανιχνεύονται μέσω του συζεύγματος στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνης με χρήση κυτταρομετρητή ροής όπου η ένταση του εκπεμπόμενου φθορισμού είναι ανάλογη της συγκέντρωσης του προϊόντος PCR. Με επιτυχία ανιχνεύθηκαν και τα τρία εξεταζόμενα είδη γάλακτος με όριο ανίχνευσης 1,4 pM, ενώ κατέστη δυνατή και η ανίχνευση προσμίξεων αγελαδινού γάλακτος σε πρόβειο και κατσικίσιο σε χαμηλό ποσοστό ίσο με 0,01%.
Abstract (translated): Food adulteration in particular milk and dairy products is regarded as one of the most important issues that consumers are facing today defending their right to know the accurate constitution of the food products that they buy. In recent years, milk and dairy products experience an increasing demand from consumers and are recognized as healthy and natural products. As a result, they are vulnerable to fraud by adulteration with other milk of lower cost. Thus, the development of new and sensitive analytical methods for the detection of the species-specific milk products is of a great need in order to protect consumers from fraudulence. The present work focuses on the detection of specific DNA sequences for the identification of the animal origin of milk in foodstuffs. Two methods were developed, a chemiluminescent and a fluorescent one which were applied for the detection of cow, sheep and goat milk. First step of both methods is the amplification of specific DNA sequences by the polymerase chain reaction (PCR). The first method is a subsequent chemiluminometric hybridization assay carried out in polystyrene microtiter wells. It is based on the DNA complementarity, the sensitive enzyme-substrate interaction and the emission of chemiluminescence. The amplified DNA sequences used are biotinylated so they can be easily detected. The intensity of the chemiluminescence is linearly related to the concentration of the corresponding DNA sequence. The limit of detection of the proposed method was 1.4 pM for all the three DNA sequences. Finally, different mixtures of yogurt from goat or sheep milk were prepared that contained various proportions of yogurt from cow. As low as 0.01% of cow milk that was present in the milk products of sheep or goat was successfully detected. The second method that was developed is a fluorescent hybridization assay for DNA detection using a suspession of spectrally distinct polystyrene microspheres which contain two fluorescence dyes at specific ratios. The basic steps of this method are the covalent attachment of specific sequences (probes) on the surface of each microsphere. The target DNA is hybridized with the immobilized probes and the hybrids are detected by using another fluorescent label via a streptavidin-phycoerythrin conjugate. The suspension of microspheres is interrogated by flow cytometer. The intensity of the emitted fluorescence is proportional to the concentration of the PCR product. The method was applied for the detection of goat, sheep and cow milk. The limit of detection of the proposed method was 1,4 pM for all the three DNA sequences. As in the previous method, different mixtures of yogurt from goat or sheep milk were prepared that contained various proportions of yogurt from cow. As low as 0,01% of cow milk that was present in the milk products from sheep or goat was successfully detected.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Kounelli(chem).pdf2.72 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons