Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/10810
Title: Ο ρόλος των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 και Cdc6 στην γονιδιακή ενίσχυση και στην ανθεκτικότητα σε αντικαρκινικά φάρμακα
Other Titles: Replication licensing factors Cdt1 and Cdc6 in gene amplification and drug resistance
Authors: Πετρόπουλος, Μιχαήλ
Keywords: Αντιγραφή του DNA
Γονιδιακή ενίσχυση
Ανθεκτικότητα σε φάρμακα
Καρκίνος
Keywords (translated): DNA replication
Cdt1
Cdc6
Gene amplification
Drug resistance
Cancer
Abstract: Στους ευκαρυωτικούς οργανισμούς, η διαδικασία της αδειοδότησης της αντιγραφής εξασφαλίζει την διατήρηση της γονιδιωματικής σταθερότητας. Η αδειοδότηση της αντιγραφής πραγματοποιείται από το τέλος μίτωσης έως την G1 φάση του κυτταρικού κύκλου και επιτρέπει την αντιγραφή ολόκληρου του γονιδιώματος μόνο μια φορά σε κάθε κυτταρικό κύκλο. Σημαντικό παράγοντα σε αυτή την διαδικασία αποτελεί η πρωτεΐνη Cdt1, η οποία είναι ενεργή από το τέλος της μίτωσης έως την G1 φάση και συνεργάζεται με τους παράγοντας Cdc6 και ORC ώστε να στρατολογήσει μόρια ελικασών MCM2-7 στις θέσεις έναρξης της αντιγραφής. Στα μετάζωα, ο παράγοντας Cdt1 ρυθμίζεται αρνητικά από την Geminin από την φάση S έως την μίτωση. Διάφορες in vitro και in vivo μελέτες έχουν δείξει ότι η απορρύθμιση της έκφρασης των παραγόντων αδειοδότησης της αντιγραφής Cdt1 και Cdc6 συμβάλλουν στην πρόκληση γονιδιωματικής αστάθειας και ακολούθως στην εξέλιξη της καρκινογένεσης. Η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί μια μορφή γονιδιωματικής αστάθειας η οποία είναι συχνό φαινόμενο στα καρκινικά κύτταρα. Η γονιδιακή ενίσχυση συμμετέχει στην προαγωγή της καρκινογένεσης μέσω της ενεργοποίησης ογκογονιδίων καθώς και μέσω της αύξησης των αντιγράφων γονιδίων που παίζουν ρόλο στην εκδήλωση ανθεκτικότητας σε φάρμακα. Παράλληλα, τα γονίδια που ενισχύονται στους διάφορους καρκίνους αποτελούν δείκτες πρόγνωσης και απόκρισης στην θεραπεία. Στόχος της μελέτης ήταν να διερευνηθεί εάν η γονιδιακή ενίσχυση αποτελεί άμεση συνέπεια της επαναντιγραφής εξαιτίας της υπερέκφρασης των παραγόντων Cdt1 και Cdc6. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ως μοντέλο η ανθεκτικότητα στο αντικαρκινικό φάρμακο μεθοτρεξάτη. Αρχικά εκτιμήθηκε η τοξικότητα του φαρμάκου σε NIH3T3 κύτταρα και υπολογίστηκε η μέση θανατηφόρος δόση μέσω της τεχνικής ΜΤΤ. Στην συνέχεια, σε κύτταρα NIH3T3 τα οποία υπερεκφράζουν τους παράγοντες Cdt1 και Cdc6 ελέγχθηκε η εκδήλωση ανθεκτικότητας στην μεθοτρεξάτη μέσω του σχηματισμού ανθεκτικών αποικιών. Πράγματι, η εκτοπική έκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 οδήγησε στην εμφάνιση μεγαλύτερης συχνότητας ανθεκτικών αποικιών στη μεθοτρεξάτη. Κύριος μηχανισμός ανθεκτικότητας στο συγκεκριμένο φάρμακο, αποτελεί η αυξημένη ενεργότητα του ενζύμου DHFR, εξαίτιας ενίσχυσης του αντίστοιχου γονιδίου. Για το σκοπό αυτό, ελέγχθηκαν τα αντίγραφα του γονιδίου DHFR στις ανθεκτικές στην μεθοτρεξάτη αποικίες με την χρήση της Real-Time PCR. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε αύξηση των αντιγράφων του γονιδίου DHFR.Μελέτες έχουν δείξει ότι σημαντικό μηχανισμό στην δημιουργία της γονιδιακής ενίσχυσης διαδραματίζουν οι διπλές κατατμήσεις στο γενετικό υλικό. Επόμενος στόχος ήταν να ελέγξουμε εάν η εκτοπική έκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 είναι ικανή να επάγει την πρόκληση αντιγραφικού στρες και την δημιουργία διπλών κατατμήσεων στο γενετικό υλικό. Για το σκοπό αυτό, ελέγχθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των δεικτών βλάβης γH2AX και pRPA32 με την χρήση ανοσοφθορισμού και μετρήθηκε η μέση ένταση του φθορισμού με την χρήση του προγράμματος ImageJ. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι η υπερέκφραση των παραγόντων Cdt1 και Cdc6 επάγει τον σχηματισμό διπλών κατατμήσεων στο γενετικό υλικό. Σύμφωνα με όλα τα παραπάνω, η απορρύθμιση της αδειοδότησης της αντιγραφής μπορεί να επηρεάσει την εξέλιξη της καρκινογένεσης μέσω αύξησης των αντιγράφων συγκεκριμένων γονιδίων.
Abstract (translated): In eukaryotes, tight regulation of DNA replication initiation is required in order to maintain genome stability. DNA replication licensing, a process which takes place during late mitosis and G1 phase, ensures faithful replication in time and space. Cdt1 is an essential regulator of DNA licensing that accumulates only in G1 phase of the cell cycle and cooperates with Cdc6 and ORC to recruit MCM2-7 helicases onto replication origins. In metazoans, Cdt1 is negatively regulated by Geminin from S to M phase. In vitro and in vivo studies have shown that aberrant expression of Cdt1 and Cdc6 induces rereplication which contributes to aneuploidy and genomic instability. A common event in cancer cells is gene amplification, a type of genomic instability which induces both oncogene activation and drug resistance. Gene amplifications have prognostic as well as therapeutic significance in clinical cancer treatment. We aimed to investigate whether gene amplification is a direct consequence of rereplication. To this end, Cdt1 and Cdc6 were ectopically expressed in NIH3T3 cells to induce rereplication. Methotrexate toxicity as well as LD50 (Lethal-Dose 50) was evaluated in NIH3T3 cells using the MTT assay. Formation of resistant colonies to the chemotherapeutic drug methotrexate was then assessed. The main mechanism of acquired resistance to methotrexate is the increase in DHFR copy number due to gene amplification. We show that overexpression of Cdt1 along with Cdc6 can indeed enhance the acquisition of drug resistance. In order to assess the potential of these factors to induce gene amplification, DHFR copy number was evaluated in drug resistant colonies. Methotrexate resistant colonies exhibited increased DHFR copy number. Furthermore, gene amplification is a type of chromosomal instability which is initiated by endogenous DNA breaks. Therefore, we aimed to investigate whether ectopic expression of licensing factors Cdt1 and Cdc6 induces replication stress and the formation of double-strand breaks in ΝΙΗ3Τ3 cells. Immunofluorescence against phosphorylated histone H2AX (γH2AX) and against pRPA32 was performed in NIH3T3 cells over expressing Cdt1 and Cdc6 and γH2AX and RPA32 integrated density was measured using custom ImageJ macros. Analysis revealed that overexpression of Cdt1 and Cdc6 can induce the generation of DNA breaks. Taken together our data suggest that deregulated replication licensing may directly affect cancer cell evolution through promoting increases in gene copy number.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Petropoulos(med).pdf2.07 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.