Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/11433
Title: Μοριακοί μηχανισμοί αντίστασης στη χημειοθεραπεία στον καρκίνο παχέος εντέρου στον άνθρωπο
Other Titles: Molecular mechanisms of human colon cancer resistance to chemotherapy
Authors: Τσούμας, Δημήτριος
Keywords: Καρκίνος παχέος εντέρου
Επιθήλιο μεσεγχυματική μετατροπή
Keywords (translated): Colon cancer
Epithelial to mesenchymal transition
EMT
ILK
Abstract: Ο καρκίνος του παχέος εντέρου αποτελεί σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνησιμότητας παγκοσμίως, ερχόμενος μόλις δεύτερος σε σειρά μετά τον καρκίνο του πνεύμονα στους άνδρες και τον καρκίνο του μαστού στις γυναίκες. Ο ακρογωνιαίος λίθος της θεραπείας του καρκίνου του παχέος εντέρου είναι η ριζική χειρουργική εκτομή του πρωτοπαθούς όγκου και η εκτομή των ηπατικών και πνευμονικών μεταστάσεων. Χημειοθεραπεία εφαρμόζεται συμπληρωματικά σε ασθενείς με υψηλό κίνδυνο υπότροπής νόσο σταδίου ΙΙΙ, αλλά και υπό συγκεκριμένες προυποθέσεις με αντικρουόμενα αποτελέσματα σε νόσο σταδίου ΙΙ και παρηγορητικά σε ασθενείς με ανεγχείρητη μεταστατική νόσο. Η χημειοθεραπεία που περιλαμβάνει την φλουοροπυριμιδίνη 5-fluorouracil (5-FU) σε συνδυασμό με Oxaliplatin (FOLFOX) η irinotecan (FOLFIRI) αποτελεί την καθιερωμένη θεραπεία πρώτης γραμμής ασθενών με μεταστατική νόσο καθώς και την καθιερωμένη προφυλακτική θεραπεία ασθενών με θετικούς λεμφαδένες. Αν και τα τελευταία χρόνια έχει επιτευχθεί σημαντική πρόοδος στην θεραπεία του μεταστατικού καρκίνου του παχέος εντέρου με τον συνδυασμό χημειθεραπευτικών φαρμάκων και την εισαγωγή νέων βιολογικών φαρμάκων, σημαντικό ποσοστό των ασθενών δεν ανταποκρίνονται στην χημειοθεραπεία και η νόσος συχνά εξελίσσεται η υποτροπιάζει έτσι ώστε η 5ετής επιβίωση των ασθενών να εξακολουθεί να παραμένει χαμηλή Πολλαπλοί και πολύπλοκοι μοριακοί μηχανισμοί εμπλέκονται στην εγγενή ή επίκτητη αντίσταση των καρκινικών κυττάρων στην χημειοθεραπεία.. Τα τελευταία χρόνια κερδίζει σημαντικό έδαφος η θεωρία ότι ένας μικρός πληθυσμός κυττάρων στους όγκους με ιδιότητες αρχέγονων κυττάρων (κύτταρα με ικανότητα αυτό-ανανέωσης και διαφοροποίησης) που ονομάζονται αρχέγονα καρκινικά κύτταρα (Cancer Stem Cells-CSC or cancer initiating cells), είναι υπεύθυνος για την αντίσταση στα χημειοθεραπευτικά και την υποτροπή της νόσου. Κύτταρα με χαρακτηριστικά αρχέγονων κυττάρων έχουν απομονωθεί από καρκινώματα παχέος εντέρου βάσει της έκφρασης δεικτών αρχέγονων κυττάρων όπως CD44, CD133 και Lgr5. Tα κύτταρα αυτά επιπλέον των ιδιοτήτων των αρχέγονων κυττάρων εμφανίζουν, χαρακτηριστικά, αντίσταση στην χημειοθεραπεία και αυξημένη ικανότητα διήθησης και μετάστασης λόγω απόκτησης φαινοτύπου επιθηλιο-μεσεγχυματικής μετάβασης (Epithelial-Mesenchymal Transition-EMT). Τελευταία δεδομένα υποστηρίζουν ότι η ΕΜΤ σχετίζεται με αντίσταση στην χημειοθεραπεία και με την απόκτηση ιδιοτήτων αρχέγονων κυττάρων . Δεδομένου λοιπόν ότι η αντίσταση στην χημειοθεραπεία αποτελεί μεγάλο εμπόδιο στην επιτυχή θεραπευτική αντιμετώπιση των ασθενών με καρκίνο του παχέος εντέρου, η αποσαφήνιση των εμπλεκόμενων μηχανισμών και η ανεύρεση προβλεπτικών βιοδεικτών αναμένεται να έχει μεγάλο κλινικό όφελος. Η Integrin-linked kinase (ILK), μία κινάση σερίνης/θρεονίνης που εντοπίζεται στις πλάκες εστιακής πρόσφυσης, εμπλέκεται σημαντικά στην καρκινογένεση στον άνθρωπο και αποτελεί ένα νέο πολλά υποσχόμενα θεραπευτικό στόχο στον καρκίνο. Η ILK ενέχεται στην κυτταρική προσκόλληση στην εξωκυττάρια ουσία και στην μεταγωγή σημάτων από ιντεγκρίνες και αυξητικούς παράγοντες, ρυθμίζοντας σημαντικές κυτταρικές λειτουργίες όπως ο κυτταρικός πολλαπλασιασμός, η απόπτωση, η διαφοροποίηση, η κυτταρική προσκόλληση και μετανάστευση, η διήθηση, η μετάσταση και η επιθηλιο-μεσεγχυματική μετάβαση (EMT). Υπερέκφραση της ILK έχει δειχθεί σε πολλές νεοπλασίες του ανθρώπου και συχνά σχετίζεται με επιθετική βιολογική συμπεριφορά και κακή πρόγνωση. Επιπλέον, πολλά δεδομένα, τόσο από in vitro πειράματα όσο και από ζωικά μοντέλα καρκίνου παχέος εντέρου, αποδίδουν στην ILK σημαντικό ρόλο στην καρκινογένεση του παχέος εντέρου. Πρόσφατα μάλιστα δεδομένα συνδέουν την με μηχανισμούς ακτινο- και χημειοαντίστασης στο γαστρικό και παγκρεατικό καρκίνο. Ωστόσο λίγα είναι γνωστά για τον ρόλος της στους μηχανισμούς αντίστασης στην χημειοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο. Σκοπός της προτεινόμενης μελέτης είναι να εξετάσουμε την συμμετοχή της σηματοδότησης από την ILK στους μηχανισμούς αντίστασης στην χημειοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου στον άνθρωπο και να διερευνήσουμε την σημασία της ILK ως θεραπευτικού στόχου και ως βιοδείκτη πρόβλεψης της ανταπόκρισης στην χημειοθεραπεία. Οι συγκεκριμένοι στόχοι της μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου των αλλαγών στην σηματοδότηση από την ILK και της φαρμακευτικής στόχευσης της ILK στην αντίσταση στην χημειοθεραπεία των καρκινικών κυττάρων του παχέος εντέρου in vitro και των αλλαγών στην σηματοδότηση από την ILK σε ιστικά δείγματα καρκινώματος παχέος εντέρου ασθενών με διαφορετική ανταπόκριση στην χημειοθεραπεία. Για το σκοπό αυτό δημιουργήσαμε ανθεκτικές κυτταρικές σειρές ΗΤ-29 στα χημειοθεραπευτικά φάρμακα 5-fluorouracil (5-FU) και Oxaliplatin και 1) εξετάσουμε δείκτες ΕΜΤ καθώς και την σηματοδότηση από την ILK με μεθοδολογία Western Immunoblotting και ανοσοφθορισμό και 2) εξετάσαμε την επίδραση της φαρμακευτικής αναστολής της ILK με τον ειδικό αναστολέα QLT0267 στην ανταπόκριση στα χημειοθεραπευτικά φάρμακα 5-fluorouracil (5-FU) και Oxaliplatin καθώς και στην έκφραση δείκτων ΕΜΤ. Επιπλέον μελετήσαμε με ανοσοιστοχημεία την έκφραση της ILK, δεικτών ΕΜΤ και δεικτών αρχέγονων καρκινικών κυττάρων του εντέρου (Cancer Stem Cells, CSC) σε ιστικά δείγματα ασθενών με μεταστατική νόσο σε σχέση με την ανταπόκριση σε χημειοθεραπευτικά φάρμακα βασισμένα στην 5-FU Επιπλέον, στα ιστικά δείγματα αξιολογήσαμε την σημασία αυτών των πρωτεϊνών ως προβλεπτικών βιοδεικτών. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν ότι τα ανθεκτικά ΗΤ-29 κύτταρα στην 5-fluorouracil (5-FU) αλλά όχι στην οξαλιπλατίνη εμφανίζουν μορφολογία μεσεγχυματικών κυττάρων και εκφράζουν δείκτες ΕΜΤ, τόσο στην ανοσοαποτύπωση κατά Westren όσο και στο ανοσοφθορισμό, όπως μειωμένη έκφραση του επιθηλιακού δείκτη Ε-κατχερίνη και αυξημένη έκφραση των μεσεγχυματικών δεικτών βιμεντίνη και Snail. Tα ανθεκτικά ΗΤ-29 κύτταρα στην 5-fluorouracil (5-FU) και οξαλιπλατίνη είναι περισσότερο ευαίσθητα στον ειδικό αναστολέα της ILK QLT0267 σε σχέση με τα κύτταρα ΗΤ29, ενώ η φαρμακευτική αναστολή της ILK με τον ειδικό αναστολέα QLT0267 μείωσε σημαντικά τα επίπεδα της p-Akt και την ανθεκτικότητα στα χημειοθεραπευτικά5-fluorouracil (5-FU) και οξαλιπλατίνη. Επίσης, στα ανθεκτικά ΗΤ-29 κύτταρα στην 5-fluorouracil (5-FU) η φαρμακευτική αναστολή της ILK με τον ειδικό αναστολέα QLT0267 οδήγησε και στην μείωση της έκφρασης των δεικτών ΕΜΤ. Στα ιστικά δείγματα ασθενών με μεταστατικό καρκίνο παχέος εντέρου η έκφραση των δεικτών ΕΜΤ Ε-κατχερίνη και β-κατενίνη, ή έκφραση του δείκτη αρχέγονων καρκινικών κυττάρων του εντέρου CD44 αλλά όχι των CD133 και Lgr5, καθώς και η έκφραση της ILK σχετίστηκαν στατιστικώς σημαντικά με την κακή ανταπόκριση στην χημειοθεραπέια. Η πολυπαραγοντική μάλιστα ανάλυση έδειξε ότι η ILK αποτελεί ανεξάρτητο προβλεπτικό δείκτη της κακής ανταπόκρισης στην χημειοθεραπέια βασισμένη σε 5-FU. Τα αποτελέσματα της μελέτης μας συμφωνούν με βιβλιογραφικά δεδομένα που υποστηρίζουν την συμμετοχή της διεργασίας της ΕΜΤ στην αντίσταση στην χημειοθεραπέια. Αυτή είναι η πρώτη μελέτη που αναδεικνύει την συμμετοχή της ILK στους μηχανισμούς αντίστασης στην χημειοθεραπεία στον καρκίνο του παχέος εντέρου και την καθιστά πολλά υποσχόμενο θεραπευτικό στόχο Περαιτέρω μελέτες απαιτούνται για να αξιολογηθεί ο ρόλος της ILK ως προβλεπτικός βιοδείκτης της ανταπόκρισης των ασθενών στην χημειοθεραπεία και η συνέργεια φαρμακευτικών αναστολέων της ILK με άλλα χημειοθεραπευτικά με σκοπό τη μείωση της αντίστασης στην χημειοθεραπεία
Abstract (translated): Colorectal cancer (CRC) is a major cause of morbidity and mortality worldwide. Radical resection of primary tumor and lung or hepatic metastases is the standard therapeutic approach for colon cancer patients. Chemotherapy is performed in patients at high risk for relapse -adjuvant therapy in stage II and stage III disease-, and in patients with unresectable metastatic disease. First line chemotherapy for metastatic CRC as well as recommended adjuvant therapy for lymph node positive-disease includes combination regimens of the anti metabolite drug 5-fluorouracil (5-FU) with either the DNA-binding agent oxaliplatin (FOLFOX regimen) or the toposisomerase I inhibitor irrinotecan (FOLFIRI). However despite the treatment advances in recent years, 50% of the patients with metastatic CRC will not respond to chemotherapy and their disease will progress or relapse so that overall survival rates remain low. Thus resistanse to chemotherapy is a major problem that prevents efficient treatment of CRC patients. Although several mechanisms are involved in chemotherapy resistance a novel theory that has recently gained much attention is the cancer stem cell theory. Cells with CSC properties have been isolated from colorectal carcinomas based on cancer stem cell markers such as CD44, CD133 και Lgr5. These cells not only show properties of stem cells, such as the ability to self-renew and differentiate, but also they are highly resistant to chemotherapeutic drugs and they also have increased ability to invade and metastasize due to the acquisition of an Epithelial-mesenchymal transition phenotype.Recent data support the notion that EMT is a critical process involved in both chemoresistance and generation of cancer stem cells. Therefore successful targeting of mechanisms regulating EMT and CSC properties are expected to prevent tumor progression and may have major impact on the clinical manegement of CRC patients. Integrin-linked kinase (ILK) a widely expressed serine/threonine protein kinase located in focal adhesions is known to be critically involved in human carcinogenesis and represents a novel anti-cancer therapeutic target The overexpression or constitutive activation of ILK either in cell culture or in transgenic mouse models results in oncogenic progression and ILK expression predicts poor patient survival in several types of cancers. ILK oncogenic functions is shown to be mediated by regulation of pathways involved in cell proliferation, survival, cell adhesion-migration and EMT such as the Wnt/beta-catenin pathway, PI3K/Akt pathway and EMT regulators Snail and E-cadherin Notably several studies both in vito and with animal models of colon cancer have shown that ILK is critically implicated in colon carcinogenesis We also showed that ILK oncogenic functions in colon cancer as well as in other human cancers are mediated by beta-catenin activation and induction of an EMT-phenotype (Bravou et al., 2006;) Interestingly, previous studies have implicated ILK in mechanisms of radiotherapy and chemotherapy resistance in pancreatic cancer and gastric cancer. However, despite all these data linking ILK to colon carcinogenesis and mechanisms of drug-resistance the role of ILK in colon cancer hemotherapy resistance has not been previously addressed. The aim of this study is to investigate ILK’s role in colon cancer chemoresistance and to address whether ILK represents a promising therapeutic target and a useful predictor of chemotherapy response. We generated 5-FU resistant and oxaliplatin resistant HT29 cells and studied 1) cell morphology and markers of EMT including E-cadherin, Snail, β-catenin and Vimentin at the protein level by Western immunoblotting and immunofluorescence 2) the effect of ILK inhibitor QLT0267 on the response of 5-FU resistant and oxaliplatin resistant HT29 cells to 5-FU and oxaliplatin by MTT and on the expression of EMT markers expression by Western immunoblotting and immunofluorescence. Protein levels of CSC: CD44, CD133 and lgr5, of EMT markers: E-cadherin and beta-catenin, as well as of ILK. were also evaluated by immunohistochemistry in FFPE tissue samples of metastatic CRC patients treated with 5-FU based chemotherapy and their levels correlated with response to treatment. 5-FU resistant but not oxaliplatin resistant HT29 cells showed mesenchymal morphology and increased expression of EMT markers. The ILK inhibitor QLT0267 was more effective in resistant compared to parental HT29 cells. Specific pharmacological inhibition of ILK reduced levels of p-AKt and chemoreststance to 5-FU and oxaliplatin. Moreover expression of EMT markers and CSC marker CD44 in human CRC speciments significantly correlated with poor response to 5FU based chemotherapy. Importantly ILK overexpression in human CRC correlated with poor response and was shown to represent an independent predictor of resistance to 5FU based chemotherapy. Our results suggest that gain of an EMT phenotype contributes to chemoresistance in colorectal cancer and implicate for the first time the overxpression of ILK in mechanisms of chemoresistance in human CRC. ILK seems to represent a promising biomarker and therapeutic target in human CRC.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Nemertes_Tsoumas(chem).pdf4.97 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.