Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/11768
Title: Διερεύνηση του βιολογικού ρόλου της ανθρώπινης ριβονουκλεάσης Ζ
Other Titles: Study of the biological role of human ribonuclease Z
Authors: Σόκατ, Αθανάσιος-Νασίρ
Keywords: Ριβονουκλεάση Ζ
Μεταφορικό RNA
Ρυθμιστικά μόρια RNA
Γονιδιωματική επεξεργασία
Ωρίμανση tRNAs
Θραύσματα tRNA
Keywords (translated): Ribonuclease Z
RNase Z
tRNA
tRNA biogenesis
sncRNAs
lncRNAs
Genome editing
CRISPR/Cas9
tRNA-derived fragments
Abstract: Η ριβονουκλεάση Ζ (RNase Z) είναι η υπεύθυνη ενδονουκλεάση για την αφαίρεση των 3’ ακόλουθων αλληλουχιών από τα πρόδρομα μόρια tRNA, ένα απαραίτητο βήμα όχι μόνο για τη βιογένεση των tRNAs αλλά επίσης για την παραγωγή μίας νέας ομάδας μικρών μη κωδικών μορίων RNA, τα οποία ονομάζονται tRNA-derived fragments (tRFs). Στον άνθρωπο υπάρχουν δύο μορφές RNase Z, η RNase ZL (92.2 kD) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC2 και η RNase ZS (40kD) η οποία κωδικοποιείται από το γονίδιο ELAC1. H RNase ZL είναι υπεύθυνη για την ωρίμανση τόσο των πυρηνικών όσο και των μιτοχονδριακών RNA, για την παραγωγή tRFs της σειράς 1 καθώς και για την ωρίμανση σημαντικών μεγάλων μη κωδικών RNAs (lncRNAs) όπως το MALAT-1. Από την άλλη, η RNase ZS (ELAC1) έχει μέχρι τώρα απροσδιόριστο βιολογικό ρόλο και εντοπίζεται εξ’ ολοκλήρου στο κυτταρόπλασμα. Για να διαλευκανθεί ο ρόλος της RNase ZS αλλά και για να μελετηθεί περαιτέρω η RNase ZL, αρχικά, κύτταρα Α549 καλλιεργήθηκαν σε συνθήκες στέρησης θρεπτικών στοιχείων, καθώς και παρουσία Η2Ο2 ώστε να προσδιοριστούν συγκεκριμένα πρότυπα συνέκφρασης. Παρατηρήθηκε ταυτόχρονη αύξηση των ELAC1-ANG γεγονός που αναδεικνύει τον ρόλο αυτών των πρωτεϊνών σε αποκρίσεις στο στρες αλλά και στη δημιουργία θραυσμάτων tRNAs. Στη συνέχεια υπερεκφράστηκαν τα γονίδια ELAC1 και ELAC2 σε καρκινικά κύτταρα πνεύμονα Α549 με σκοπό τη μελέτη των επιπέδων έκφρασης σημαντικών γονιδίων τα προϊόντα των οποίων συμμετέχουν στην ωρίμανση αλλά και στη θραύση tRNAs, στη ρύθμιση του κυτταρικού κύκλου, στο μηχανισμό RNAi και παράλληλα μελετήθηκαν και τα επίπεδα έκφρασης σημαντικών lncRNAs. Επιπλέον έγινε ανάλυση του κυτταρικού κύκλου μετά από την υπερέκφραση για να δούμε πως επηρεάζεται από τις συγκεκριμένες πρωτεΐνες. Το πρότυπο έκφρασης για αυτά τα γονίδια, ύστερα από υπερέκφραση του ELAC1 αναδεικνύει τον προστατευτικό ρόλο που ενδέχεται να έχει η RNase ZS καθώς μειορυθμίζονται lncRNAs που ευνοούν τη μετάσταση και την επαναφορά σε μία βλαστική κατάσταση. Παράλληλα τα επίπεδα έκφρασης των AGO1 και AGO2 ήταν μειωμένα σε σημαντικό βαθμό και πιθανότατα να επηρεάζεται πληθώρα mRNAs που στοχεύονται από σύμπλοκα RISC (RNA-induced silencing complex) τα οποία περιέχουν μία από αυτές τις AGO πρωτεΐνες. Υπερεκφράζοντας το γονίδιο ELAC2 παρατηρήθηκε ένα πρότυπο έκφρασης από όλα τα γονίδια που μελετήθηκαν το οποίο υποδηλώνει ότι η RNase ZL ευνοεί το πολλαπλασιασμό των καρκινικών κυττάρων και τη μετάσταση. Επιπλέον, αλλάζοντας την αναλογία των επιπέδων έκφρασης των AGO γονιδίων πιθανότατα επάγει περαιτέρω πλειοτροπικές αλλαγές στα κύτταρα. Τέλος, στη παρούσα διπλωματική εργασία δημιουργήθηκε μία κυτταρική σειρά HEK-293T στην οποία απαλείφθηκε το γονίδιο ELAC1 με την χρήση της τεχνικής γονιδιωματικής επεξεργασίας CRISPR-Cas9 και πιστοποιήθηκε η έλλειψη μιας σημαντικής ριβονουκλεάσης. Η απουσία της πρωτεΐνης δεν φαίνεται να επηρεάζει τη βιωσιμότητα των κυττάρων αλλά επίσης ούτε τη μορφολογία και την κατανομή των κυττάρων στις διαφορετικές φάσεις του κυτταρικού κύκλου.
Abstract (translated): Ribonuclease Z (RNase Z) is the endonuclease responsible for the removal of the 3’ trailer sequences from tRNA precursors, an essential step not only in tRNA biogenesis, but also in the production of a new class of small non-coding RNAs, termed tRNA-derived fragments (tRFs). In human, two RNase Z forms exist, RNase ZL (92.2 kD) encoded by the ELAC2 gene and RNase ZS (40 kD) encoded by the ELAC1 gene. RNase ZL is responsible for the maturation of both nuclear and mitochondrial tRNAs, the generation of series- tRNA-derived fragments and the maturation of essential long non-coding RNAs (lncRNAs) such as MALAT-1. On the other hand, RNase ZS (ELAC1) has elusive, so far, biological role and has been reported to be present exclusively in the cytoplasm. To elucidate the role of RNase ZS, but also to further study RNase ZL, initially, A549 cells were grown under nutrient starvation or in the presence of Η2Ο2 in order to identify specific co-expression patterns. A simultaneous increase of ANG and ELAC1 expression was observed, thus verifying the role of both of proteins in stress response and tRNA fragmentation. Furthermore, ELAC1 and ELAC2 genes were overexpressed in A549 lung cancer cells with the aim to study the expression levels of key genes encoding proteins involved in tRNA maturation and fragmentation, cell cycle regulation, RNAi along with the expression of several important lncRNAs. Also, cell cycle analysis of transfected A549 was performed to check if it is affected by these two proteins. The expression pattern of the above-mentioned genes after overexpressing ELAC1 brings out the possible protective role of RNase ZS, since lncRNAs that promote metastasis and the regression in a stem-like state. Meanwhile the expression levels of AGO1 and AGO2 were lowered in a great extent and it is possible that many mRNAs targeted by AGO1- or AGO2-loaded RNA-induced silencing complexes are affected. By overexpressing ELAC2 the expression pattern observed indicates that RNase ZL favors cell proliferation of cancer cells, metastasis and by changing the ratio of AGO genes it is possible that great amount of processes can be affected. The most important element of the present thesis was the creation of a HEK-293T ELAC1 knock-out cell line. For the creation of this cell line the versatile CRISPR-Cas9 system was used. The elimination of RNase ZS was confirmed via Western Blotting. The cells are viable and the absence of the protein affects neither the cell morphology nor the distribution of cells in each cell cycle phase.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Nemertes_Shaukat(med).pdf8.98 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.