Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/11997
Title: Επίδραση της β-τρυπτάσης στη παραγωγή συστατικών του εξωκυττάριου χώρου από ινοβλάστες ρινικού πολύποδα ανθρώπου
Other Titles: Effect of β-tryptase on the production of extracellular components from human nasal polyps fibroblasts
Authors: Βοεράκος, Ιωάννης
Keywords: Ρινικός πολύποδας
Τρυπτάση
Ινοβλάστες
Εξωκυττάριος χώρος
Keywords (translated): Nasal polyps
Tryptase
Fibroblasts
Extracellular matrix
Abstract: Ο ρινικός πολύποδας είναι μια χρόνια φλεγμονώδης πάθηση του ρινικού βλεννογόνου, που χαρακτηρίζεται από διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, κυρίως ηωσινόφιλων, τροποποιήσεις στην διαφοροποίηση του επιθηλίου, αναδιαμόρφωση του ιστού, που περιλαμβάνει υπερπλασία της βασικής μεμβράνης, συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και οίδημα, με αποτέλεσμα την δημιουργία χαρακτηριστικών μορφομάτων που αποφράζουν τις ανώτερες αναπνευστικές οδούς. Αν και η παθογένεια της νόσου δεν έχει ακόμα αποσαφηνιστεί, η πυροδότησή της πιθανώς οφείλεται στον τραυματισμό που υφίσταται το επιθήλιο λόγω αλλεργιών ή άλλων άγνωστων παραγόντων, καθώς και ιογενών λοιμώξεων. Όπως και σε διάφορες άλλες ασθένειες και φλεγμονώδεις αντιδράσεις, έτσι και στον ρινικό πολύποδα, παρατηρούνται διαδικασίες του ιστού που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό τον ινοβλαστών. Σε αυτές τις περιπτώσεις, κοινά χαρακτηριστικά είναι ο αυξημένος αριθμός των ινοβλαστών/μυοϊνοβλαστών και η εναπόθεση συστατικών του εξωκυττάριου χώρου. Ακόμα, συνήθης είναι η παρουσία των σιτευτικών κυττάρων, τα οποία φαίνεται να κατέχουν σημαντικό ρόλο στην ίνωση, καθώς μπορούν να απελευθερώσουν πληθώρα μεσολαβητών που ενδεχομένως εμπλέκεται στην διαδικασία αυτή. Ιδιαίτερο ενδιαφέρον έχει ένα από τα προϊόντα των σιτευτικών κυττάρων, η σερινοπρωτεάση τρυπτάση, η οποία παρουσιάζει μιτογόνο δράση στους ινοβλάστες, κυρίως μέσω ενεργοποίησης του υποδοχέα ενεργοποιούμενου από πρωτεάσες-2 (PAR-2). Έχει αναφερθεί ότι η τρυπτάση επάγει τον πολλαπλασιασμό ινοβλαστών πνεύμονα, νεφρού και επιπεφυκότα οφθαλμού, καθώς και την έκφραση του κολλαγόνου τύπου I, της ινονεκτίνης και της κυκλοοξυγονάσης-2 (COX-2) από τα ίδια κύτταρα. Στην παρούσα εργασία, διερευνάται η παρουσία σιτευτικών κυττάρων, που παράγουν τρυπτάση, σε ιστούς ρινικού πολύποδα, καθώς και η επίδραση που έχει η ανθρώπινη τρυπτάση στον πολλαπλασιασμό καλλιεργημένων ινοβλαστών ρινικού πολύποδα, και στην έκφραση διάφορων παραγόντων από αυτούς, οι οποίοι εμπλέκονται στην παθογένεια της νόσου. Συλλέχθηκαν ρινικοί πολύποδες από ασθενείς που υπέφεραν από χρόνια ρινίτιδα με πολυποδίαση, μετά από ενδοσκοπική χειρουργική επέμβαση, και φυσιολογικοί ρινικοί βλεννογόνοι από υγιή άτομα, που αποτέλεσαν την ομάδα ελέγχου, έπειτα από χειρουργική επέμβαση του διαφράγματος. Ινοβλάστες ρινικού πολύποδα παρελήφθησαν ύστερα από καλλιέργεια μικρών τεμαχίων του ιστού σε πλαστικές φιάλες σε μέσο καλλιέργεια DMEM και μετανάστευση των ινοβλαστών από τα τεμάχια του ιστού. Η παρουσία των σιτευτικών κυττάρων στους ιστούς ρινικού πολύποδα επιβεβαιώθηκε με ιστοχημική χρώση με την μέθοδο Giemsa/κυανούν της τολουιδίνης, και ο εντοπισμός της τρυπτάσης στα κύτταρα αυτά, με ανοσοϊστοχημική χρώση με τη μέθοδο του συμπλέγματος αβιδίνης-βιοτίνης-υπεροξειδάσης (ABC), χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης τρυπτάσης. Τα επίπεδα της IL-6, της IL-8 και του TIMP-1 στο μέσο καλλιέργειας των κυττάρων προσδιορίστηκαν με ELISA, ενώ τα επίπεδα της MMP-2 με ζυμογράφημα ζελατίνης. Η έκφραση των COX-1, COX-2, ICAM-1, PAR-2, κολλαγόνο τύπου I, TIMP-1 και της ινονεκτίνης από καλλιεργημένους ινοβλάστες ρινικού πολύποδα ή από ιστούς ρινικού πολύποδα διαπιστώθηκε με ημι-ποσοτική PCR ή PCR πραγματικού χρόνου (real-time PCR). Τέλος, η μελέτη του κυτταρικού πολλαπλασιασμού πραγματοποιήθηκε με την μέθοδο MTT, ενώ η δραστικότητα τρυπτάσης εξετάστηκε χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα BARNA. Μέσω ιστοχημικής χρώσης διαπιστώθηκε η παρουσία σιτευτικών κυττάρων στο καλυπτήριο επιθήλιο και στο στρώμα ρινικού πολύποδα. Πραγματοποιήθηκε περαιτέρω επιβεβαίωση μέσω ανοσοϊστοχημείας, χρησιμοποιώντας ειδικό αντίσωμα έναντι της ανθρώπινης τρυπτάσης, και παρατηρήθηκε ότι τόσο στο καλυπτήριο επιθήλιο όσο και στο στρώμα ιστών ρινικού πολύποδα απαντώνται σιτευτικά κύτταρα που παράγουν τρυπτάση. Χρησιμοποιώντας το υπόστρωμα BARNA, ανιχνεύτηκε ενζυμική δραστικότητα στο μέσο καλλιέργειας ιστών ρινικού πολύποδα, η οποία κατεστάλη σημαντικά από το αναστολέα της τρυπτάσης APC 366, υποδεικνύοντας την παρουσία ενεργής τρυπτάσης στο μέσο καλλιέργειας, ως αποτέλεσμα της αποκοκκίωσης των σιτευτικών κυττάρων στον ιστό του ρινικού πολύποδα. Με RT-PCR ανάλυση δείχθηκε ότι η έκφραση της COX-1, της COX-2 και του PAR-2 ήταν αυξημένη στον πολύποδα σε σχέση με τον φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο, υποδηλώνοντας ότι αυτοί οι παράγοντες μάλλον εμπλέκονται στην παθογένεια του ρινικού πολύποδα. Επίσης μέσω RT-PCR, αποδείχθηκε ότι οι ινοβλάστες ρινικού πολύποδα εκφράζουν τον PAR-2, μέσω του οποίου ασκείται η μιτογόνος δράση της τρυπτάσης στα κύτταρα αυτά, όπως επιβεβαιώθηκε με την χρήση του ανταγωνιστή του PAR-2, GB-83. Επίσης, καλλιέργεια ινοβλαστών ρινικού πολύποδα που πραγματοποιήθηκε παρουσία τρυπτάσης, έδειξε ότι η τρυπτάση επάγει την έκφραση των COX-1, COX-2, κολλαγόνου τύπου I, ινονεκτίνης και ICAM-1, μέσω ενεργοποίησης του PAR-2, το οποίο επιβεβαιώθηκε επίσης με την χρήση του GB-83. Ακόμα, η τρυπτάση δείχθηκε ότι επάγει την παραγωγή της MMP-2, ενώ καταστέλλει την παραγωγή του TIMP-1. Ωστόσο, δεν παρουσίασε καμία επίδραση στην παραγωγή IL-6 και IL-8 από τους ινοβλάστες ρινικού πολύποδα. Με την χρήση αναστολέων των MAP κινασών, βρέθηκε ότι οι MEK1/2, JNKs και p38 κινάσες εμπλέκονται στην έκφραση του κολλαγόνου τύπου I, του ICAM-1 και της ινονεκτίνης, ενώ μόνο οι MEK1/2 και οι JNKs εμπλέκονται στην έκφραση της COX-1. Τα σιτευτικά κύτταρα φαίνεται ότι προσελκύονται στον φλεγμένοντα ρινικό βλεννογόνο όπου και απελευθερώνουν τρυπτάση, η οποία με την σειρά της διεγείρει την παραγωγή παραγόντων που συνεισφέρουν στην συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και την ίνωση, από ινοβλάστες του στρώματος, με αποτέλεσμα τη δημιουργία και ανάπτυξη του ρινικού πολύποδα.
Abstract (translated): Nasal polyposis is a chronic inflammatory disease of the nasal mucosa, that is characterized by inflammatory cell infiltration, in particular of eosinophils, modifications of epithelial differentiation, tissue remodelling, including basement membrane thickening, extracellular matrix (ECM) accumulation, and edema, resulting in the growth of characteristic formations and in the obstruction of the upper respiratory tracts. Although the pathogenesis of disease still remains unknown, the epithelium damage, caused by allergy or other unknown reason, as well as viral infection, may be responsible for disease initiation. Like polyposis, numerous other diseases and inflammatory reactions are associated with fibroproliferative tissue responses. Increased numbers of fibroblasts/ myofibroblasts and deposition of extracellular matrix proteins are the common features. Mast cells usually are present in these cases and seem to be key players in fibrosis. They secrete a plethora of potent mediators, which may be involved in the pathogenesis of fibrosis. One mast-cell product, the serine protease tryptase, is of special interest and has been shown to exert fibroproliferative action, most likely via activation of the protease-activated receptor 2 (PAR-2). It has been reported that tryptase is able to induce the proliferation of various origination fibroblasts, such as renal, lung and conjunctival, as well as the expression of collagen type I, fibronectin and cyclooxygenase-2 (COX-2) in these cells. In this study, we investigated the presence of tryptase-positive mast cells in polyps tissues, and the effects of human tryptase on the proliferation of cultured polyps fibroblasts and the expression of various factors in these cells, that are implicated in polyps pathogenesis. Nasal polyps were resected by functional endoscopic sinus surgery from patients suffering from chronic sinusitis with polyposis. The control group consisted of healthy subjects from whom healthy nasal mucosa was taken during nasal septoplasty-inferior turbinoplasty. Polyps fibroblasts were obtained from polyps tissues, after culture of small tissue explants in plastic flasks in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) and migration of fibroblasts from tissue explants. The presence of mast cells in polyps tissues was ascertained by histochemical staining with Giemsa / Toluidine blue and the localization of tryptase in these cells with immunohistochemical staining by the avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) method, using specific antibody against human tryptase. The levels of IL-6, IL-8 and TIMP-1 in cell culture conditioned media were determined by ELISA and these of MMP-2 by gelatin zymography. The expression of COX-1, COX-2, ICAM-1, PAR-2, collagen type I, TIMP-1 and fibronectin in cultured polyps fibroblasts or in polyps tissues was ascertained by semi-quantitative PCR or real-time PCR. The study of cell proliferation was performed by MTT method, whereas the assay for tryptase activity was performed using the BARNA substrate. By histochemistry it was ascertained the presence of mast cells in the coverage epithelium as well as in the stroma of polyps tissues. This observation was further confirmed by immunohistochemistry, using specific antibody against human tryptase. Tryptase-positive mast cells were detected in both the coverage epithelium and the stroma of polyps tissues. Using the substrate BARNA, enzymatic activity was detected in polyps tissue culture conditioned media, which was inhibited with the tryptase inhibitor APC 366, indicating the presence of active tryptase in conditioned media, that may be resulted from degranulation of mast cells in polyps tissue. RT-PCR analysis showed that the expression of COX-1, COX-2 and PAR-2 was higher in polyps than in normal nasal mucosa, indicating that these factors may be implicated in the polyps pathogenesis. RT-PCR also showed that polyps fibroblasts express PAR-2 through of which tryptase exerted proliferative activity on these cells, as it was ascertained by using the PAR-2 antagonist GB-83. Culture of polyps fibroblasts in the presence of tryptase showed that it caused up-regulation of collagen type I, fibronectin, COX-1, COX-2 and ICAM-1 expression, via activation of PAR-2 as it was ascertained using the PAR-2 antagonist GB-83. Tryptase was also able to induce the production of MMP-2. On the other hand, tryptase caused suppression of TIMP-1 production, while it had not any effect on IL-6 and IL-8 production by polyps fibroblasts. Using MAPK inhibitors it was found that MEK1/2, JNKs and p38 are implicated in the expression of collagen type I, ICAM-1 and fibronectin, while only MEK1/2 and JNKs are implicated in the expression of COX-1. It appears that mast cells are attracted in inflamed nasal mucosa where they secrete tryptase which in turn stimulate the stromal fibroblasts to produce factors that contribute in the ECM accumulation and fibrosis, and consequently in polyps formation and development.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)



This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons