Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/12119
Title: Eπίδραση της επαγόμενης απο Wnt-1 πρωτεΪνης-1 (Wisp-1) στην έκφραση συστατικών του εξωκυττάριου χώρου σε ινοβλάστες αρθρικού υμένα, ρινικού πολύποδα και πτερυγιού οφθαλμού ανθρώπου
Other Titles: Effect of Wnt-1 inducible signaling protein-1 (Wisp-1) on the expression of extracellular matrix components in human synovial membrane, nasal polyps and eye pterygium fibroblast
Authors: Ευσταθίου, Βασίλειος
Keywords: Πτερύγιο οφθαλμού ανθρώπου
Ρινικός πολύποδας ανθρώπου
Κολλαγόνο τύπου-1
Keywords (translated): Ηuman eye pterygium
Human nasal polyps
Wnt-1
Wisp-1
IL-6
TIMP-1
Type-1 collagen
MIF
Abstract: H ρινική πολυποδίαση και το πτερύγιο οφθαλμού είναι φλεγμονώδεις νόσοι του ρινικού βλεννογόνου και της οφθαλμικής επιφανείας, αντίστοιχα, οι οποίες χαρακτηρίζονται από διήθηση φλεγμονωδών κυττάρων, υπερπλασία του επιθηλίου και των ινοβλαστών του στρώματος, ανάπλαση ιστού και μη φυσιολογική συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού. Αυξημένη έκφραση IL-6, κολλαγόνου τύπου-I και TIMP-1 έχει διαπιστωθεί σε ιστούς ρινικού πολύποδα και πτερυγίου σε σύγκριση με το φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο και επιπεφυκότα, αντίστοιχα. Η Wisp-1 (γνωστή και σαν CCN4), μια πρωτεΐνη που επάγεται από το Wnt-σηματοδοτικό μονοπάτι, είναι μέλος της οικογένειας πρωτεϊνών CCN, στην οποία ανήκουν, η πρωτεΐνη πλούσια σε κυστεΐνη-61 (Cyr61/CCN1), ο αυξητικός παράγοντας συνδετικού ιστού (CTGF/CCN2), η πρωτεΐνη που υπερεκφράζεται στο νεφροβλάστωμα (NOV/CCN3) και οι πρωτεΐνες Wisp-1/CCN4, Wisp-2/CCN5, και Wisp-3/CCN6. Αυτή η οικογένεια γονιδίων κωδικεύει εκκρινόμενες πρωτεΐνες οι οποίες αλληλεπιδρούν με συστατικά του εξωκυττάριου χώρου και παίζουν σημαντικό ρόλο στη μετανάστευση, τη προσκόλληση, το πολλαπλασιασμό, την απόπτωση, την επιβίωση, τη φλεγμονή και την επούλωση τραυμάτων. H Wisp-1 υπερεκφράζεται σε διάφορες παθολογικές καταστάσεις που χαρακτηρίζονται από ίνωση, όπως η ιδιοπαθής πνευμονική ίνωση, και επάγει την έκφραση συστατικών του εξωκυττάριου χώρου, όπως κολλαγόνου και ινονεκτίνης, σε πνευμονικούς ινοβλάστες. Έχει αναφερθεί ότι η Wisp-1 υπερεκφράζεται και στον αρθρικό υμένα και το χόνδρο ασθενών με οστεοαρθρίτιδα και επάγει τη παραγωγή IL-6 από ινοβλάστες αρθρικού υμένα και προάγει την απελευθέρωση MMPs και αγγρικανάσης από μακροφάγα και χονδροκύτταρα, που προκαλλούν καταστροφή του χόνδρου. Επιπλέον, φαίνεται ότι υπάρχει αλληλεπίδραση μεταξύ του σηματοδοτικού μονοπατιού του TGF-β1 με αυτό της Wisp-1, αφού από τη μια μεριά η Wisp-1 μειώνει σημαντικά την επαγόμενη από τον TGF-β1 φωσφορυλίωση της SMAD-2, και από την άλλη μεριά ο TGF-β1 διεγείρει το κανονικό Wnt-1 σηματοδοτικό μονοπάτι, μέσω καταστολής του Wnt-1 ανταγωνιστή Dickkopf-1, επάγοντας την έκφραση της Wisp-1. Σκοπός της παρούσης εργασίας ήταν η διερεύνηση της έκφρασης των Wnt-1 και TGF-β1 σε ιστούς ρινικού πολύποδα και πτερυγίου σε σχέση με το φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο και επιπεφυκότα, αντίστοιχα, και σε σύγκριση με τους ινοβλάστες αρθρικού υμένα ασθενών με οστεοαρθρίτιδα, η μελέτη της επίδρασης της Wisp-1 στην έκφραση συστατικών του εξωκυττάριου χώρου σε ινοβλάστες ρινικού πολύποδα και πτερυγίου. Ιστοί ρινικού πολύποδα συλλέχθηκαν από ασθενείς πάσχοντες από χρόνια ρινίτιδα και πολυποδίαση ύστερα από χειρουργική αφαίρεση. Φυσιολογικός ρινικός βλεννογόνος συλλέχθηκε από υγιείς δότες κατά τη διάρκεια επέμβασης διόρθωσης του ρινικού διαφράγματος. Ιστοί πτερυγίου συλλέχθηκαν μετά από χειρουργική αφαίρεση πρωτογενούς πτερυγίου και ιστοί φυσιολογικού επιπεφυκότα συλλέχθηκαν από υγιείς δότες κατά τη διάρκεια χειρουργικής επέμβασης καταρράκτη. Αρθρικοί υμένες συλλέχθηκαν από ασθενείς με οστεοαρθρίτιδα που υποβλήθηκαν σε ολική αρθροπλαστική γόνατος. Από όλους τους παραπάνω ιστούς απομονώθηκαν ινοβλάστες ύστερα από ήπια επεξεργασία με βακτηριακή κολλαγονάση. Τα επίπεδα IL-6 και MIF στο μέσο καλλιέργεια των κυττάρων προσδιορίσθηκαν με ELISA. Η έκφραση IL-6, κολλαγόνου τύπου-I και TIMP-1 στις καλλιεργημένες ινοβλάστες ή του TGF-β1 και της Wnt-1 στους ιστούς, διαπιστώθηκε με ημι-ποσοτική RT-PCR ανάλυση. RT-PCR ανάλυση έδειξε ότι η πρωτεΐνη Wnt-1 εκφράζεται τόσο στο πτερύγιο όσο και στο ρινικό πολύποδα. Η έκφραση της Wnt-1 ήταν μεγαλύτερη στο φυσιολογικό επιπεφυκότα συγκριτικά με το πτερύγιο. Αντίθετα, η έκφραση της Wnt-1 ήταν μεγαλύτερη στο ρινικό πολύποδα σε σχέση με το φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο. Από την άλλη μεριά, η RT-PCR ανάλυση έδειξε επίσης ότι η έκφραση του TGF-β1 ήταν μεγαλύτερη στο φυσιολογικό ρινικό βλεννογόνο συγκριτικά με το ρινικό πολύποδα, ενώ δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στην έκφραση του TGF-β1 μεταξύ πτερυγίου και φυσιολογικού επιπεφυκότα. Καλλιέργεια των ινοβλαστών παρουσία ανασυνδιασμένης Wisp-1 έδειξε ότι αυτή προκάλεσε αυξορύθμιση στην έκφραση της IL-6 στις ινοβλάστες αρθρικού υμένα και πτερυγίου, αλλά μειορύθμιση στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα, κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Σημειώνεται, ότι η Wisp-1 δεν επηρέασε την έκφραση της IL-6 στις ινοβλάστες τόσο του φυσιολογικού ρινικού βλεννογόνου, όσο και του φυσιολογικού επιπεφυκότα. Όταν οι ινοβλάστες καλλιεργήθηκαν παρουσία του TGF-β1, μόνου ή μαζί με Wisp-1, παρατηρήθηκε καταστολή της επαγόμενης από τον TGF-β1 έκφρασης της IL-6 στις ινοβλάστες αρθρικού υμένα και ρινικού πολύποδα από τη Wisp-1, ενώ αυτή δεν είχε καμία επίδραση στην επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση της IL-6 στις ινοβλάστες πτερυγίου. Η Wisp-1 προκάλεσε επίσης αυξορύθμιση στην έκφραση του TIMP-1 σε αμφότερες τις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα και πτερυγίου κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, ενώ κατέστειλε την επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση του TIMP-1 και στις δύο ινοβλάστες. Παρόμοια, η Wisp-1 προκάλεσε αυξορύθμιση στην έκφραση του κολλαγονου τύπου-Ι σε αμφότερες τις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα και πτερυγίου κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο, όμως αυτή κατέστειλε την επαγόμενη από τον TGF-β1 έκφραση του κολλαγονου τύπου-Ι μόνο στις ινοβλάστες πτερυγίου, ενώ δεν την επηρέασε στις ινοβλάστες ρινικού πολύποδα. Επιπρόσθετα, η Wisp-1 προκάλεσε σημαντική αυξορύθμιση στη παραγωγή του MIF και από τα τρία είδη ινοβλαστών που δοκιμάστηκαν, κατά δοσο-εξαρτώμενο τρόπο. Έχει αναφερθεί ότι η Wisp-1 αποτελεί στόχο του μονοπατιού Wnt. Το μονοπάτι Wnt / β-κατενίνης μάλλον εκφράζεται και λειτουργεί τόσο στο ρινικό πολύποδα όσο και στο πτερύγιο. Είναι πιθανόν ότι ένας αρχικός τραυματισμός, που προκαλείται από την υπεριώδη ακτινοβολία στο πτερύγιο ή από διάφορους παράγοντες στο ρινικό πολύποδα, οδηγεί σε αυξημένη έκφραση της Wisp-1 από τα επιθηλιακά κύτταρα. Με την εξαίρεση των ινοβλαστών ρινικού πολύποδα, όσον αφορά στην έκφραση της IL-6, η απελευθερούμενη Wisp-1 στη συνέχεια, μέσω παρακρινών επιδράσεων, διεγείρει τις στρωματικές ινοβλάστες να παράγουν παράγοντες που μπορούν να συνεισφέρουν στη συσσώρευση εξωκυττάριου υλικού και στην ίνωση. Από την άλλη μεριά, η Wisp-1 καταστέλλει την επαγόμενη από τον TGF-β1 παραγωγή των ίδιων παραγόντων από τους στρωματικούς ινοβλάστες και επάγει την παραγωγή MIF, ενός γνωστού προ-φλεγμονώδους παράγοντα, από τα κύτταρα αυτά. Μια τέτοια επίδραση της Wisp-1 παρουσιάζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Λαμβάνοντας υπόψη όλες αυτές τις παρατηρήσεις, δεν είναι δυνατόν, προς το παρόν, να διατυπωθεί μια άποψη σχετικά με τον ακριβή ρόλο της Wisp-1 στον σχηματισμό και την ανάπτυξη του ρινικού πολύποδα και του πτερυγίου.
Abstract (translated): Nasal polyposis and eye pterygium are two inflammatory diseases of the nasal mucosa and ocular surface, respectively, characterized by inflammatory cell infiltration, modifications of epithelial differentiation, tissue remodeling, and abnormal extracellular matrix accumulation. High expression of IL-6, type-I collagen, and TIMP-1 has been identified in nasal polyps and pterygium tissues in comparison with normal nasal mucosa and eye conjunctiva, respectively. Wnt-inducible signaling pathway protein-1 (Wisp-1, also known as CCN4) belongs to the CCN gene family, which contains cysteine-rich 61 (Cyr61/CCN1), connective tissue growth factor (CTGF/CCN2), nephroblastoma overexpressed (NOV/CCN3), Wisp-1/CCN4, Wisp-2/CCN5, and Wisp-3/CCN6. This gene family encodes secreted proteins that interact with the extracellular matrix and have important roles in migration, adhesion, proliferation, apoptosis, survival, inflammation, and injury repair. Wisp-1 is highly expressed in several pathologic conditions characterized by fibrosis, such as the idiopathic pulmonary fibrosis, and induces the expression of extracellular matrix components, such as type-I collagen and fibronectin in lung fibroblasts. It has been reported that Wisp-1 is strongly up-regulated in the synovial membrane and articular cartilage of patients with osteoarthritis and is able to induce the production of IL-6 from synovial fibroblasts and elicit the release of MMPs and aggrecanase from macrophages and chondrocytes, which cause cartilage damage. In addition, it appears that a functional relationship between Wisp-1 and TGF-β1 signaling pathways occurs, since Wisp-1 significantly reduces TGF-β1-induced phosphorylation of SMAD-2, while TGF-β1 stimulates the canonical Wnt-1 signaling pathway through the suppression of Wnt-1 antagonist, Dickkopf-1, leading to stimulation of Wisp-1 expression. The aim of this work was the investigation of Wnt-1 and TGF-β1 expression in nasal polyps and pterygium tissues in comparison with normal nasal mucosa and conjunctiva, respectively, as well as the study of Wisp-1 effects on the expression of various extracellular matrix components in nasal polyps and pterygium fibroblast, having on mind the known effects of Wisp-1 on synovial fibroblasts. Nasal polyps were resected by functional endoscopic sinus surgery from patients suffered from chronic sinusitis with polyposis. The control group consisted of healthy subjects from whom healthy nasal mucosa was taken during nasal septoplasty-inferior turbinoplasty. Pterygium specimens were obtained after the surgical removal of primary pterygium. Specimens of normal human conjunctiva were obtained from healthy donors, during cataract surgery. Synovial membranes were obtained from patients with osteoarthritis subjected in total knee arthroplasty. Fibroblasts were isolated from all the above tissues upon mild treatment by clostridium collagenase. The levels of IL-6 and MIF in cell cultures conditioned media were determined by ELISA. The expression of IL-6, type-I collagen and TIMP-1 in cultured fibroblasts or of TGF-β1 and Wnt-1 in tissues was ascertained by semi-quantitative RT-PCR. RT-PCR analysis showed that Wnt-1 is expressed in pterygium as well as in nasal polyps. The expression of Wnt-1 was higher in normal conjunctiva than in pterygium. On the contrary, the expression of Wnt-1 was higher in polyps than in normal nasal mucosa. On the other hand, RT-PCR analysis showed also that the expression of TGF-β1 was higher in normal nasal mucosa than in polyps, while was not observed statistically significant difference in the expression of TGF-β1, between pterygium and normal conjunctiva. Culture of fibroblasts in the presence of rhWisp-1 showed that it caused up-regulation of IL-6 expression in synovial and pterygium fibroblasts but down-regulation in polyps fibroblasts, in a dose-depended manner. It is noticed that Wisp-1 did not affect the expression of IL-6 in normal mucosa and conjunctiva fibroblasts. When fibroblasts were cultured in the presence of TGF-β1, alone or together with Wisp-1, a suppression of TGF-β1-induced expression of IL-6 in polyps and synovial fibroblasts by Wisp-1 was observed, while it had not any effect on TGF-β1-induced expression of IL-6 in pterygium fibroblasts. Wisp-1 caused also up-regulation of TIMP-1 in both the polyps and pterygium fibroblast in a dose-depended manner, while it suppressed the TGF-β1-induced expression of TIMP-1 in both fibroblasts. Similarly, Wisp-1 caused up-regulation of type-I collagen in both the polyps and pterygium fibroblast in a dose-depended manner, however, it suppressed the TGF-β1-induced expression of type-I collagen only in pterygium fibroblasts, while it did not affect this TGF-β1 effect in polyps fibroblasts. In addition, Wisp-1 caused significant up-regulation of MIF production from all the three kinds of fibroblasts tested, in a dose-depended mode. Wisp-1 is reported to be a Wnt target. The Wnt/β-catenin pathway may be expressed and is operative in nasal polyps and pterygium. It is possible that an initial injury, caused by UV irradiation in pterygium or by various factors in nasal polyps, leads to Wisp-1 increased expression by epithelial cells. By exception of polyps fibroblasts, regarding the expression of IL-6, the released Wisp-1 subsequently, through paracrine effects, stimulates the stromal fibroblasts to produce factors that may contribute in the extracellular matrix accumulation and fibrosis. On the other hand, Wisp-1 suppresses the TGF-β1-induced production of the same factors from stromal fibroblasts and induces the production of MIF, a known pro-inflammatory factor, from these cells. A such effect of Wisp-1 is presented for the first time in literature. Taken to account all these observations, it is not possible, at the present time, to express an opinion related to exactly role of Wisp-1 in polyps and pterygium formation and development.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
DV REVISION -ΒΑΣΙΛΗΣ ΜΕΤΑΠΤΥΧΙΑΚΗ ΕΡΓΑΣΙΑ FINAL. new.pdf2.03 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.