Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/12185
Title: Phenotype-genotype correlations in patients with GNRH deficiency
Other Titles: Συσχετίσεις φαινοτύπου-γονοτύπου σε ασθενείς με έλλειψη της GNRH
Authors: Στάμου, Μαρία
Keywords: GNRH
Genetics
Whole exome sequencing
Keywords (translated): Έλλειψη της GNRH
Γενετικές διαταραχές
Abstract: Isolated Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) Deficiency (IGD) is a rare disease with a wide spectrum of reproductive and non- reproductive clinical characteristics. Apart from the phenotypic heterogeneity, IGD is also a genetically enriched disease with >35 genes being implicated in its pathophysiology. When IGD is associated with anosmia it is referred as Kallmann Sydnrome (KS), whereas its normosmic phenotype is known as normosmic idiopathic hypogonadotropic hypogonadism (nIHH). Apart from those two rare forms of the disease, GnRH deficiency spans a wide spectrum of other disorders such as constitutional delay of puberty (CDP), hypothalamic amenorrhea (HA) as well as the adult onset of hypogonadotropic hypogonadism (AHH). Non- reproductive features of the disease include unilateral renal agenesis, synkinesia, cleft lip and palate, dental agenesis, eye and heart defects and many more. Genes associated with IGD can either affect the neurodevelopmental GnRH pathway, i.e. the migration of the GnRH neurons along the olfactory neurons to the hypothalamus, or the neuroendocrine pathway of the GnRH secretion and/or action. Despite the large number of genes that are associated with the disease, ~60% of the patients remain genetically uncharacterized. Different strategies have been utilized for the gene discovery including analysis of chromosomal rearrangements, sequencing of syndromic cases, candidate- gene approach and studies of endogamous families/ populations. Utilizing next- generation –sequencing (NGS) techniques the number of genes and variants being identified is increasing significantly and more genes are now emerging as candidate IGD genes. Thus, before the field moves forward we would need to pause and look how the “known” IGD genes have been discovered and if genetic enrichment exists in IGD subpopulations such as the Greek IGD cohort. Scope of the study: In the first part of the study we performed a retrospective review of important genes that have been associated with IGD. We used the recently published criteria by MacArthur et al to test the candidacy of the “known” IGD genes based on the gene disruption, expression in relevant tissues, biochemical function, protein- protein interactions, animal studies, rescue experiments and burden testing. In the second part of our study we analyzed the largest cohort of Greek patients with IGD ever been studied and performed detailed phenotyping and genotyping, with the goal to estimate the prevalence of genetic variation in this sub-population. We used both a “traditional” approach, i.e. Sanger sequencing, and whole exome sequencing (WES) to determine if application of NGS has any effect on the estimation of prevalence of genetic variation and oligogenicity in the cohort studied. Methods: For the first part of our analysis we performed a systematic review of the literature for all studies published on 24 “known” IGD genes. For the second part of our analysis we performed detailed phenotyping and genetic screening utilizing Sanger sequencing in 81 probands looking for variation in 14 genes vs. WES in 87 probands, searching for genetic variation in 37 genes. The pathogenicity of the detected RSVs was estimated based on segregation data, conservational data, in vitro and in silico analysis. Results: Even though all known IGD genes seem to fulfill the criteria for gene disruption, biochemical function, protein- protein interactions and tissue expression, data are more limited when it comes to animal studies, rescue experiments and burden testing. However, NSG will enable the sequencing of large IGD and control cohort making statistical studies more feasible in the future. With regards to analysis of the Greek cohort detailed phenotyping revealed a variety of phenotypic characteristics with renal agenesis and synkinesia being enriched in patients with KS. Sanger sequencing detected a prevalence of genetic variation in 26% of the IGD patients sequenced in 7/14 IGD genes without any evidence of oligegenicity. WES revealed that 31% of IGD patients carrying a rare genetic change in a total of 15 genes with 4,5% of the IGD cases being oligogenic. Discussion: Tremendous efforts have been undertaken by many researches to discover novel IGD genes and several studies have attempted to establish pathogenicity of the genes and/ or variants detected, including animal studies and other experiments. NGS has yielded many genes and variants in diseased and control cohorts, making burden testing a crucial step in gene validation. In our study we used NGS in a large IGD cohort of Greek patients showing prevalence of genetic variation in 1/3 of the cohort. In addition, we were able to detect oligogenicity, suggesting that NGS techniques can discover previously undetected variation and will soon become the standardized method for screening patients with rare and/ or more common disorders.
Abstract (translated): H μεμονωμένη έλλειψη της ορμόνης GnRH είναι μία σπάνια κληρονομούμενη νόσος και χαρακτηρίζεται από ένα ευρύ φάσμα κλινικών χαρακτηριστικών αναπαραγωγής και μη. Εκτός από τη φαινοτυπική ετερογένεια, η νόσος αυτή θεωρείται γενετικά πλούσια με > 35 γονίδια να ενέχονται στη παθοφυσιολογία της. Όταν η έλλειψη της GnRH ορμόνης σχετίζεται με ανοσμία, τότε η νόσος ονομάζεται Συνδρομο Kallmann (ΣΚ), ενώ όταν οι σθενείς έχουν φυσιολογική όσφρηση, τότε αναφέρεται ως ιδιοπαθής υπογοναδοτροπικός υπογοναδισμός (ΙΥΥ). Εκτός από τις δύο αυτές μορφές της νόσου, η έλλειψη της GnRH αφορά και ένα πλήθος άλλων ασθενειών όπως η καθυστέρηση της ήβης, η υποθαλαμική αμηνόρροια και ο υπογοναδοτροπικός υπογοναδισμός ενήλικης έναρξης. Μη αναπαραγωγικά χαρακτηριστικά περιλαμβάνουν την αγενεσία νεφρού, συγκινησία, ανωμαλίες μέσης γραμμής, διαταραχές όρασης, καρδιαγγειακές διαταραχές κ.α. Τα γονίδια που σχετίζονται με τη νόσο επηρεάζουν είτε το νευροαναπτυξιακό μονοπάτι της GnRH (δηλαδή τη μετανάστευση των νευρώνων της GnRH στον υποθάλαμο), είτε το νευροενδοκρινές μονοπάτι της έκκρισης και δράσης της ορμόνης αυτής. Παρά το μεγάλο αριθμό των γονιδίων που έχουν συσχετιστεί με τη νόσο, σε ~60% των ασθενών τα γενετικά αίτια παραμένουν άγνωστα. Διάφορες στρατηγικές και τεχνικές έχουν χρησιμοποιηθεί για την ανακάλυψη γονιδίων όπως η ανάλυση χρωμοσωμικών ανωμαλιών, η ανάλυση περιστατικών με συνδρομικά χαρακτηριστικά, μελέτες ενδογαμικών οικογενειών ή και μεμονωμένων πληθυσμών. Με τη χρήση τεχνικών "νέας γενιάς" (next- generation –sequencing/ NGS) ο αριθμός των γονιδίων και των μεταλλάξεων αυξάνεται ολοένα και περισσότερο και πολλά καινούρια γονίδια φαίνεται να σχετίζονται με σπάνιες αλλά κια πιο συχνές νόσους. Επομένως, προτού η επιστημονική κοινότητα προχωρήσει σε ανακάλυψη καινούριων γονιδίων πραγματοποιήσαμε μία μελέτη στα ήδη γνωστά γονίδια της νόσου και εξετάσαμε το γενετικό υπόβαθρο των Ελληνων ασθενών με μεμνωμμένη έλλειψη της GnRH. Σκοπός της μελέτης: Στο πρώτο μέρος της διατριβής πραγματοποιήσαμε μια αναδρομική μελέτη των σημαντικών γονιδίων της νόσου. Για τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε τα κριτήρια που έχουν δημοσιευθεί από τον MacArthur και τους συνεργάτες του για να εξετάσουμε το εάν τα γονίδια αυτά προκαλούν τη νόσο με βάση τις γενετικές μεταλλάξεις που φέρουν, την έκφραση τους σε σχετικούς με τη νόσο ιστούς, τη βιοχημική τους λειτουργία, τις συσχετίσεις με άλλες γνωστές για τη νόσο πρωτεΐνες, in vivo και in vitro πειράματα (συμπεριλαμβανομένων και τω πειραμάτων rescue), καθώς και τη στατιστική μελέτη που συγκρίνει τον αριθμό των μεταλλάξεων που φέρουν οι ασθενείς σε σύγκριση με αυτές των controls (burden test). Στο δεύτερο μέρος της μελέτης αναλύσαμε το μεγαλύτερο πληθυσμό Ελλήνων ασθενών με έλλειψη της GnRH που έχει ποτέ μελετηθεί και πραγματοποιήσαμε λεπτομερή φαινοτυπικό και γονοτυπικό έλεγχο με σκοπό να προσδιορίσουμε τη συχνότητα των μεταλλάξεων στον Ελλαδικό χώρο. Χρησιμοποιήσαμε τόσο "παραδοσιακές" τεχνικές, όπως τη μέθοδο Sanger sequencing, και νέες μεθόδους όπως το whole exome sequencing (WES) για να μελετήσουμε εάν η χρήση νέων τεχνικών έχει επίπτωση στην ανακάλυψη νέων μεταλλάξεων και στη συχνότητα με την οποία ανιχνεύεται η ολιγογονιδιακότητα. Μέθοδοι: Για το πρώτο μέρος της ανάλυσης πραγματοποιήσαμε συστηματική ανασκόπηση της βιβλιογραφίας για 24 γνωστά για τη νόσο γονίδια. Για το δεύτερο μέρος της ανάλυσης πραγματοποιήσαμε λεπτομερή φαινοτυπική μελέτη καθώς και γενετικό έλεγχο με Sanger sequencing σε 81 ασθενέις για την ανακάλυψη μεταλλάξεων σε 14 γονίδια, καθώς και WES σε 87 ασθενείς για την ανακάλυψη μεταλλάξεων σε 37 γονίδια. Η φύση των μεταλλάξεων που ανακαλύψαμε εξετάσθηκε με βάση τον τρόπο κληρονόμησής τους, τη διατήρησή τους σε διάφορα είδη, in vitro και in silico μελέτες. Αποτελέσματα: Εάν και όλα τα γνωστά γονίδια πληρούν τα κριτήρια βάση των γενετικών μεταλλάξεις που φέρουν, της έκφρασης τους σε σχετικούς με τη νόσο ιστούς, της βιοχημική τους λειτουργίας και τις συσχετίσεις με άλλες γνωστές για τη νόσο πρωτεΐνες, τα επιστημονικά στοιχεία είναι περιορισμένα σε ό,τι αφορά in vivo και in vitro πειράματα καθώς και burden testing. Ωστόσο, η χρήση τεχνικών NSG θα προσφέρει μεγαλύτερη ευχέρεια στην ανάλυση περισσοτέρων ασθενών και controls καθιστώντας τις στατιστικές μελέτες πιο εύκολες στο μέλλον. Σε ό,τι αφορά τη μελέτη των Ελλήνων ασθενών, λεπτομερής φαινοτυπικός έλεγχος ανέδειξε μία πλειάδα κλινικών χαρακτηριστικών με τη νεφρική αγενεσία και τη συγκινησία να εμφανίζονται με μεγαλύτερη συχνότητα σε ασθενείς με ΣΚ. Η χρήση της μεθόδου Sanger sequencing ανέδειξε μεταλλάξεις στο 26% των Ελλήνων ασθενών με έλλειψη της GnRH σε 7/14 γονίδια χωρίς τη παρουσία ολιγογονιδιακότητας. Με τη χρήση του WES τo ποσοστό των ασθενών που φέρουν μεταλλάξεις ανήλθε στο 31%, με τους ασθενείς να φέρουν μεταλλάξεις σ 15 γονίδια, ενώ ολιγογονιδιακότητα ανακαλύφθηκε σε ποσοστό 4,5% του συνόλου των ασθενών. Συζήτηση: Είναι γεγονός πως εκτεταμένες προσπάθειες έχουν γίνει από πολλές ερευνητικές ομάδες για την ανακάλυψη γονιδίων της έλλειψης της GnRH. Αρκετές από αυτές έχουν καταφέρει να ανακαλύψουν γονίδια τα οποία τώρα γνωρίζουμε πως ενέχονται στη νόσο και η χρήση νέων τεχνικών αυξάνει συνεχώς τον αριθμό των γονιδίων και μεταλλάξεων που ανακαλύπτονται. Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήσαμε τεχνικές NGS και ανακαλύψαμε πως 1/3 των Ελλήνων ασθενών με ‘έλλειψη της GnRH φέρουν μεταλλάξεις σε 15/37 γνωστά γονίδια. Επιπροσθέτως ανακαλύψαμε περιστατικά ολιγογονιδιακότητας. Τα αποτελέσματα αυτά μας δείχνουν πως οι τεχνικές “νέας γενιάς” μπορούν να ανακαλύπτουν γενετικές αλλαγές που με παλαιότερες τεχνικές μπορεί να μην ήταν δυνατόν να ανακαλυφθούν και σύντομα θα είναι ο κύριος τρόπος γονιδιακού ελέγχου σε ασθενείς με σπάνιες και πιο συχνές νόσους.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
PHD THESIS_MARIA STAMOU_UNIVERSITY OF PATRAS.pdf19.47 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.