Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/12573
Title: Investigation of human bone cells response deposited on different substrates to an electrical active environment
Other Titles: Διερεύνηση της αντίδρασης ανθρώπινων οστικών κυττάρων σε διαφορετικά υποστρώματα σε ένα ηλεκτρικά ενεργό περιβάλλον
Authors: Κρουσουλούδη, Μαρία
Keywords: Cell culture
Substrates
Electrical stimulation
Osteoblasts
Keywords (translated): Κυτταροκαλλιέργεια
Υποστρώματα
Ηλεκτρική διέγερση
Οστεοβλάστες
Abstract: Nowadays, bone diseases are constantly on the rise either because of lifestyle change – population aging, increased obesity rates, minimal physical exercise - or because of permanent bone damage. To date, methods for defective bone treatment, such as autografting and allografting present short-term or long-term problems - painful and long-term processes, unpredictable bone resorption, risk of disease and / or infection that may cause a reduction or complete loss of limb - . For this reason, it is necessary to study and apply new biomaterials and techniques for bone regeneration. In this thesis, osteoblasts were differentiated from bone marrow cells isolated from hip and knee bones and cultured under suitable conditions similar to human’s body (37 ° C, 5% CO2, nutrient). Then in vitro studies were performed, and the development of osteoblasts on different types of substrates - polystyrene, smooth titanium, titanium dioxide nanotubes, rough titanium - was evaluated. Finally, through an electric stimulation device, manufactured in the laboratory, it was examined whether electrical stimulation of cells on the same substrates, as above, improves their proliferation and differentiation. The first chapter consists of two parts. The first part analyses the structure and composition of the bones, as well as the types of bone cells. The second part analyses the types of mesenchymal cells, isolated from bone marrow, and the indices of osteogenic differentiation - alkaline phosphatase, total protein. The second chapter refers to biomaterials. Firstly, the desired properties of biomaterials associated with bone engineering are presented. Then the biomaterials used in the present study, are presented, the polystyrene - its evolution over years and its conversion from plain polystyrene to bio- and the titanium - its applications in medicine and its modifications to improve its properties -. The third chapter presents the cell - material interaction. At first, the cellular environment, the extracellular matrix - synthesis and interactions - and the function of adhesion-dependent cells are described. Then the properties of the bio-interface - chemistry, topography, substrate elasticity - and cell growth factor are presented. Finally, a look at the evolution of biomaterials over the years is made. The fourth chapter is about in vitro cell culture. It first describes a cell culture, its usefulness and its conditions - nutrient, CO2, temperature -. The conditions for cell passaging are also reported, as well as the method for cell counting. Finally, a reference is made to osteoblasts, the type of cells used in our study. The fifth chapter includes electrical stimulation of cells. The human body by itself emits an electrical stimulus that enhances cellular communication. However, there is the possibility of external electrical stimulation of bone - regenerating tissues - and this chapter refers to electrical stimulation applications in the body. The sixth chapter includes the experimental part. The materials and methods used as well as the preparation of the substrates are presented. The procedure for isolation and differentiation of osteoblasts from their receipt from the hospital to their culture in the laboratory is described below. Moreover, the process of cell degradation and subculturing as well as cell counting is being explained. After that, the experimental part is divided into two sub-sections. The first section describes the cell culture in polystyrene flasks, and then the biocompatibility test on different substrates - polystyrene, titanium, titanium dioxide nanotubes, rough titanium - . The second section describes the osteoblast culture on the same substrates - polystyrene, titanium, titanium dioxide nanotubes, rough titanium - under electrical current stimuli through an electric stimulation device manufactured in the laboratory. The present investigation aimed to find an appropriate combination of parameters related to substrate characteristics (nature and topography) and an induced electrical field that leads to the proliferation and enhanced activity of osteoblast bone cells. With this purpose, a cell carrying device has been designed and used for the electrical stimulation of the human osteoblast cells. It was found that a combined effect of both applied electrical field (0.3V, 3 hours) and specific substrate nature and topography considerably increase the ration ‘alkaline phosphatase/ total protein’ (ALP/TP), which has been translated as the degree of biocompatibility. When no electric field is applied, the cells tend to increase ALP levels associated to their multiplication and proliferation on soft surfaces, while a light decrease is observed when they are seeded on rough surfaces. On the opposite, the total protein level is increased cells seeded on rough substrates, since this is related to their adhesion process. The ALP/TP is decisive for the faith osteoblasts population. Generally, a light increase in proliferation on TNTs compared to other substrates is associated with the highly organized nature of the TNTs. Results agree with already reported studies and confirm that substrate nature which includes its chemical composition, its mechanical properties, and surface topography are very important factors, decisive for osteoblasts well-functioning. When an electric field is applied, cells functions are improved. Titanium dioxide nanotubes, due to their nature and highly organized architecture, contribute to the uniform distribution of the electric field in the medium and under the bone cell population. Finally, the effect of an adjusted intensity of the electric field and the appropriate topography of the substrate on cells behaviour demonstrates the importance of these two in vitro parameters for the activity of bone forming cells and may be considered crucial in the manufacturing of advanced biomaterials for orthopaedic applications.
Abstract (translated): Στις μέρες μας, οι παθήσεις των οστών αυξάνονται συνεχώς είτε λόγω της αλλαγής του τρόπου ζωής του πληθυσμού - αύξηση του προσδόκιμου ζωής, αυξημένα ποσοστά παχυσαρκίας, ελάχιστη φυσική άσκηση - , είτε λόγω ατυχημάτων που προκαλούν μόνιμες παθήσεις στα οστά . Μέχρι σήμερα, η αντιμετώπιση των ελαττωματικών οστών, περιλάμβανε μεθόδους όπως αυτομοσχεύματος (autografting) και αλλομοσχεύματος (allografting), που παρουσιάζουν βραχυπρόθεσμα η μακροπρόθεσμα προβλήματα - επίπονες και μακροχρόνιες διεργασίες, απρόβλεπτη οστική απορρόφηση, κίνδυνος νόσου και / ή μόλυνσης που μπορεί να προκαλέσει μείωση ή πλήρη απώλεια των επαγωγικών παραγόντων του οστού - . Για το λόγο αυτό χρήζεται αναγκαία η μελέτη και εφαρμογή νέων βιοϋλικών και τεχνικών για την ανάπλαση των οστών με πρόβλημα. Στην παρούσα διπλωματική εργασία απομονώθηκαν οστεοβλάστες από μυελό του οστού ισχίου και γονάτου και καλλιεργήθηκαν σε κατάλληλες συνθήκες που προσομοιάζουν του ανθρώπινου οργανισμού (37οC, 5% CO2, θρεπτικό υλικό). Κατόπιν πραγματοποιηθούν in vitro μελέτες και εκτιμήθηκε η ανάπτυξη των οστεοβλαστών σε διαφορετικά είδη υποστρωμάτων - πολυστυρένιο, λείο τιτάνιο, νανοσωλήνες τιτανίου, αδρό τιτάνιο - . Τέλος, μέσω μιας κυψελίδας ηλεκτρικής διέγερσης που κατασκευάστηκε στο εργαστήριο, εξετάστηκε κατά πόσο η ηλεκτρική διέγερση των κυττάρων στα ίδια υποστρώματα βελτιώνει τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίησή τους. Το πρώτο κεφάλαιο αποτελείται από δύο μέρη, τα οστά και τα μεσεγχυματικά κύτταρα, τα οποία μπορούν να απομονωθούν από μυελό οστού. Στο πρώτο μέρος αναλύεται η δομή και η σύνθεσή των οστών, καθώς και τα είδη των οστικών κυττάρων. Στο δεύτερο μέρος αναλύονται οι τύποι των μεσεγχυματικών κυττάρων και οι δείκτες οστεογενικής διαφοροποίησης - αλκαλική φωσφατάση, ολική πρωτεΐνη. Το δεύτερο κεφάλαιο αναφέρεται στα βιοϋλικά. Πρώτα παρουσιάζονται οι επιθυμητές ιδιότητες των βιοϋλικών που σχετίζονται με τη μηχανική οστών. Κατόπιν παρουσιάζονται τα βιοϋλικά που χρησιμοποιήθηκαν στην παρούσα εργασία, πολυστυρένιο - η εξέλιξή του ανά τα χρόνια και η μετατροπή του από απλό πολυστυρένιο σε βιο, κατάλληλο για καλλιέργεια κυττάρων πάνω του - και τιτάνιο - οι εφαρμογές του στην ιατρική και οι τροποποιήσεις του για βελτίωση των ιδιοτήτων του - . Στο τρίτο κεφάλαιο παρουσιάζεται η αλληλεπίδραση κυττάρου και υλικού. Αρχικά περιγράφεται το κυτταρικό περιβάλλον, η εξωκυττάρια μήτρα - σύνθεση και αλληλεπιδράσεις - και η λειτουργία των κυττάρων που αναπτύσσονται προσκολλημένα στην επιφάνεια του υποστρώματος. Έπειτα αναλύονται οι ιδιότητες της βιο-διεπαφής - χημεία, τοπογραφία, ελαστικότητα υποστρώματος - και ο παράγοντας ανάπτυξης των κυττάρων. Τέλος γίνεται μία αναδρομή στην εξέλιξη των βιοϋλικών ανά τα χρόνια. Το τέταρτο κεφάλαιο πραγματεύεται την in vitro καλλιέργεια κυττάρων. Αρχικά περιγράφεται μια κυτταροκαλλιέργεια, η χρησιμότητά της και οι συνθήκες που πρέπει να επικρατούν σε αυτήν - θρεπτικό υλικό, CO2, θερμοκρασία - . Έπειτα αναφέρονται οι συνθήκες για διαχωρισμό των κυττάρων και νέα καλλιέργεια καθώς και η μέθοδος υπολογισμού των κυττάρων της καλλιέργειας. Τέλος γίνεται αναφορά στη συγκεκριμένη κατηγορία κυττάρων, οστεοβλαστών, η οποία χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα μελέτη και γιατί επιλέχθηκε. Το πέμπτο κεφάλαιο περιλαμβάνει την ηλεκτρική διέγερση των κυττάρων. Ο ανθρώπινος οργανισμός από μόνος του εκπέμπει ηλεκτρικά ερεθίσματα που συμβάλλουν στην επικοινωνία. Υπάρχει όμως και η δυνατότητα εξωτερικής ηλεκτρικής διέγερσης ιστών - οστικών οι οποίοι έχουν τη δυνατότητα ανάπλασης - και σ αυτό το κεφάλαιο αναφέρονται εφαρμογές ηλεκτρικής διέγερσης στον οργανισμό. Το έκτο κεφάλαιο περιλαμβάνει το πειραματικό μέρος. Αρχικά παρουσιάζονται τα υλικά και οι μέθοδοι που χρησιμοποιήθηκαν καθώς και η προετοιμασία των υποστρωμάτων. Στη συνέχεια περιγράφεται η διαδικασία απομόνωσης και διαφοροποίησης των οστεοβλαστών από την παραλαβή τους από το νοσοκομείο μέχρι την καλλιέργειά τους στο εργαστήριο. Έπειτα εξηγείται η διαδικασία αποκόλλησης των κυττάρων και υποκαλλιέργειας (subculturing) καθώς και ο υπολογισμός κυττάρων της κυτταροκαλλιέργειας. Κατόπιν, το πειραματικό μέρος χωρίζετε σε δύο υπομέρη. Στο πρώτο σκέλος περιγράφεται η καλλιέργεια οστεοβλαστών σε φλάσκες πολυστυρενίου, και μετά ο έλεγχος βιοσυμβατότητας σε διαφορετικά υποστρώματα - πολυστυρένιο, τιτάνιο, νανοσωλήνες διοξειδίου του τιτανίου, αδρό τιτάνιο - . Στο δεύτερο σκέλος περιγράφεται η καλλιέργεια οστεοβλαστών αντίστοιχων υποστρωμάτων - πολυστυρένιο, τιτάνιο, νανοσωλήνες διοξειδίου του τιτανίου, αδρό τιτάνιο - υπό την επήρεια ρεύματος μέσω μιας κυψελίδας ηλεκτρικής διέγερσης που κατασκευάστηκε στο εργαστήριο. Η παρούσα έρευνα στοχεύει στην εξεύρεση ενός κατάλληλου συνδυασμού παραμέτρων που σχετίζονται με τα χαρακτηριστικά του υποστρώματος (φύση και τοπογραφία) και ένα επαγόμενο ηλεκτρικό πεδίο που οδηγεί στον πολλαπλασιασμό και την ενισχυμένη δράση των οστεοβλαστών. Με αυτό το σκοπό, έχει σχεδιαστεί μια συσκευή για την ηλεκτρική διέγερση των ανθρώπινων οστεοβλαστών που απομονώθηκαν από οστικό ιστό που ελήφθη κατά τη διάρκεια ορθοπεδικής χειρουργικής επέμβασης. Ένα πεδίο συνεχούς ρεύματος εφαρμόστηκε στο μέσο καλλιέργειας και μια σειρά πρωτοκόλλων για την ηλεκτρική διέγερση των οστεοβλαστών έχουν δοκιμαστεί για να βρεθεί ο κατάλληλος συνδυασμός παραμέτρων (τάση, χρόνος, υπόστρωμα) που ενισχύουν τη δραστηριότητά τους. Διαπιστώθηκε ότι η συνδυασμένη επίδραση τόσο της εφαρμοζόμενης ηλεκτρικής περιοχής (0.3V, 3 ώρες) όσο και της ειδικής φύσης υποστρώματος και τοπογραφίας αυξάνει σημαντικά την αναλογία «αλκαλική φωσφατάση / ολική πρωτεΐνη» (ALP / TP), η οποία ερμηνεύεται ως ο βαθμός βιοσυμβατότητας. Όταν δεν εφαρμόζεται ηλεκτρικό πεδίο, τα κύτταρα τείνουν να αυξάνουν τα επίπεδα της ALP που σχετίζονται με την διαφοροποίησή τους σε μαλακές επιφάνειες, ενώ παρατηρείται ελαφρά μείωση σε τραχείες επιφάνειες. Αντίθετα, το επίπεδο ολικής πρωτεΐνης είναι αυξημένο σε κύτταρα σε ακατέργαστα υποστρώματα, καθώς αυτό σχετίζεται με τον πολλαπλασιασμό και τη διαδικασία προσκόλλησης. Το ALP / TP είναι καθοριστικό για τον πληθυσμό των οστεοβλαστών. Γενικά, μια ελαφρά αύξηση στον βαθμό διαφοροποίησης σε TNTs (νανοσωλήνων διοξειδίου τιτανίου) σε σύγκριση με άλλα υποστρώματα συνδέεται με την εξαιρετικά οργανωμένη φύση των TNTs. Τα αποτελέσματα συμφωνούν με ήδη υπάρχουσες μελέτες και επιβεβαιώνουν ότι η φύση του υποστρώματος (χημική σύνθεση, μηχανικές ιδιότητες και επιφανειακή τοπογραφία) είναι καθοριστική για την καλή λειτουργία των οστεοβλαστών. Όταν εφαρμόζεται ένα ηλεκτρικό πεδίο, βελτιώνονται οι λειτουργίες του κυττάρου. Οι νανοσωλήνες διοξειδίου του τιτανίου, λόγω της φύσης τους και της εξαιρετικά οργανωμένης αρχιτεκτονικής, συμβάλλουν στην ομοιόμορφη κατανομή του ηλεκτρικού πεδίου στο μέσο και κάτω από τον πληθυσμό των οστικών κυττάρων. Τέλος, η επίδραση μιας προσαρμοσμένης έντασης του ηλεκτρικού πεδίου και η κατάλληλη τοπογραφία του υποστρώματος στη συμπεριφορά των κυττάρων καταδεικνύουν τη σημασία αυτών των δύο in vitro παραμέτρων για την κυτταρική δραστηριότητα οστεοβλαστών και μπορούν να θεωρηθούν κρίσιμα για την κατασκευή προηγμένων βιοϋλικών για ορθοπεδικές εφαρμογές.
Appears in Collections:Τμήμα Ηλεκτρολ. Μηχαν. και Τεχνολ. Υπολογιστών (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
krousouloudi_thesis.pdf2.52 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons