Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/12768
Title: Μέθοδοι ανάλυσης DNA
Other Titles: Methods for DNA analysis
Authors: Μυριδάκη, Βασιλική
Keywords: Νοθεία
Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης
Ανίχνευση νουκλεϊκών οξέων
Φθορισμομετρική δοκιμασία
Μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου
Κυτταρομετρία ροής
Keywords (translated): Fraud
Polymerase chain reaction
Detection of nucleic acids
Polystyrene microspheres (beads)
Fluorometric hybridization assays
Flow cytometry
DNA
Abstract: Ο έλεγχος της αυθεντικότητας των τροφίμων είναι ένα ζήτημα που απασχολεί τους διεθνής και κρατικούς μηχανισμούς με σκοπό την προστασία των καταναλωτών. Κατά συνέπεια, υπάρχει αυξανόμενη ζήτηση για την ανάπτυξη νέων βελτιωμένων αναλυτικών μεθόδων για την μελέτη της αυθεντικότητας των προϊόντων διατροφής, καθώς και της ανίχνευσης νοθείας. Για το σκοπό αυτό αναπτύχθηκε μια νέα πολυαναλυτική μέθοδος για την ταυτοποίηση προϊόντων διαφόρων ειδών κρέατος, βασιζόμενη στο γενωμικό τους υλικό και στη χρήση φασματικά διακριτών μικροσφαιριδίων. Με τη μέθοδο αυτή είναι δυνατή η ταυτόχρονη ανίχνευση κρέατος βοδινού, χοιρινού, αμνού, αλόγου, κοτόπουλου και γαλοπούλας. Στο πρώτο κεφάλαιο της παρούσας εργασίας γίνεται αναφορά στην Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης (PCR), στα στάδια της μεθόδου καθώς και στην βελτιστοποίησή της, καθώς αποτελεί την πιο σημαντική μέθοδο εκθετικού πολλαπλασιασμού ειδικών αλληλουχιών DNA. Ακόμα παρουσιάζεται η μέθοδος της ποσοτικής PCR. Στο δεύτερο κεφάλαιο αναφέρονται διάφοροι μέθοδοι ανίχνευσης των νουκλεϊκών οξέων που αποτελούν ένα πολύ σημαντικό εργαλείο για την Αναλυτική Χημεία στην ανίχνευση DNA καθώς και RNA. Περιγράφονται ακόμα ετερογενείς και ομογενείς δοκιμασίες υβριδοποίησης και διάφορες παραλλαγές που διευκολύνουν την εκτέλεσή τους. Στο τρίτο κεφάλαιο παρουσιάζονται διάφορες μοριακές μέθοδοι ανάλυσης τροφίμων, εκτός από την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης. Η επιστημονική βιβλιογραφία έχει να επιδείξει έναν μεγάλο αριθμό πρωτοκόλλων ανάλυσης για μια πληθώρα νοθειών διαφόρων κατηγοριών σε πολλά είδη τροφίμων, επεξεργασμένα και μη. Κατά συνέπεια, τα αναλυτικά «εργαλεία» που είναι διαθέσιμα για την ανίχνευση της νοθείας είναι αρκετά και σε συνδυασμό με συγκεκριμένα μόρια ή ομάδα μορίων – στόχων συνήθως καλύπτουν όλες τις περιπτώσεις. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζεται το πρώτο μέρος της πειραματικής πορείας. Αρχικά, DNA που απομονώθηκε από δείγμα κρέατος υποβλήθηκε σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR), στην οποία ειδικές αλληλουχίες DNA για τα δείγματα βοδινού, χοιρινού, αμνού, αλόγου, κοτόπουλου και γαλοπούλας ενισχύθηκαν εκθετικά. Τα μεγέθη των ενισχυμένων θραυσμάτων ήταν 83 bp, 154 bp, 88 bp, 107 bp, 72 bp και 223 bp, αντίστοιχα. Τα προϊόντα της PCR είναι βιοτινυλιωμένα προκειμένου να επιτευχθεί η περαιτέρω ανίχνευσή τους, ταυτόχρονα, μέσω μιας πολυαναλυτικής δοκιμασίας υβριδοποίησης στην επιφάνεια φασματικά κωδικοποιημένων φθορίζοντων μικροσφαιριδίων. Τέλος, αντικείμενο του πέμπτου και τελευταίου κεφαλαίου της παρούσας εργασίας είναι η ανάπτυξη πολλαπλών φθορισμομετρικών δοκιμασιών DNA σε εναιώρημα φασματικών διακριτών μικροσφαιριδίων πολυστυρενίου. Τα μικροσφαιρίδια αυτά περιέχουν στο εσωτερικό τους δύο φθορίζουσες χρωστικές σε διάφορες αναλογίες, δημιουργώντας έως 100 διαφορετικούς πληθυσμούς. Ο κάθε πληθυσμός συζευγνύεται ομοιοπολικά με κατάλληλα ολιγονουκλεοτίδια-ανιχνευτές ειδικά για κάθε είδος κρέατος. Μίγμα των προϊόντων PCR, έπειτα από θερμική αποδιάταξη, αφήνεται να υβριδοποιηθεί με μίγμα που περιέχει 6 πληθυσμούς μικροσφαιριδίων ειδικούς για τις 6 υπό εξέταση αλληλουχίες DNA. Τα υβρίδια ανιχνεύονται με το σύζευγμα στρεπταβιδίνης-φυκοερυθρίνης. Τα μικροσφαιρίδια αναλύονται τέλος με κυτταρομετρία ροής. Κατά τη διάρκεια αυτής της διαδικασίας, κάθε μικροσφαιρίδιο ακτινοβολείται με 2 λέιζερ ταυτόχρονα (635nm και 532nm). Η ακτίνα στα 635nm κατηγοριοποιεί τα μικροσφαιρίδια, ενώ η ακτίνα 532nm διεγείρει την φυκοερυθρίνη, η ένταση φθορισμού της οποίας είναι ανάλογη με την ποσότητα της συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA. Η ύπαρξη 100 διαφορετικών πληθυσμών μικροσφαιριδίων επιτρέπει την επέκταση της προτεινόμενης μεθόδου για τον ταυτόχρονο προσδιορισμό περισσότερων ειδών κρέατος.
Abstract (translated): Authentication of meat products is of great importance for the protection of consumers from fraud. Consequently, there is increasing demand to develop improved analytical methods for the accurate identification of the meat species in food products and the detection of adulterants. To this end, we have developed a DNA-based assay that enables simultaneous detection of beef, pork, sheep, horse, chicken and turkey meat. The advantages of the proposed multianalyte assay include high sample-throughput, cost reduction and lower consumption of sample and reagents. In Chapter 1, the principle of Polymerase Chain Reaction is described to be the most widely used technique for the exponential amplification of specific DNA and RNA sequences. The principle of quantitative PCR is described, as well in this Chapter. In Chapter 2, methods for the detection of nucleic acids are referred to be the most significant ‘‘tool’’ for Analytical Chemistry. In addition, homogeneous and heterogeneous hybridization assays are also presented in various configurations. Chapter 3 focuses on different bioanalytical methods for food products, except for Polymerase Chain Reaction. Scientific bibliography has a variety of analysis’ protocols for fraud in food product. Reasonably, analytical ‘‘tools’’ which are available for authentication of food products are many and they could be used in many different configurations. In Chapter 4, the first part of the whole experiments is described. DNA isolated from the food sample was subjected to polymerase chain reactions (PCR) in which species–specific DNA sequences were amplified exponentially. The sizes of the amplified fragments were 83 bp, 154 bp, 88 bp, 107 bp, 72 bp and 223 bp respectively. The PCR products were thermally denatured and detected by a multianalyte hybridization assay that was performed on spectrally encoded fluorescent microspheres. Finally, Chapter 4 describes the development of multiplex fluorometric hybridization assays for DNA using a suspension of spectrally distinct polystyrene microspheres (beads). The microspheres were functionalized by covalent conjugation with species-specific oligonucleotide probes. The hybrids were detected by reacting with phycoerythrin-conjugated streptavidin. Following hybridization, the microspheres were analyzed one-by-one by flow-cytometry (in less than 1 min). During this process, each microsphere was irradiated by 2 lasers simultaneously (635nm and 532nm). The 635nm beam revealed the meat species (based on the specific probe that is attached to the microsphere) whereas the 532nm line excites the bound phycoerythrin whose fluorescence increases with the amount of species-specific DNA sequence. There are up to 100 sets of commercially available microspheres thus enabling the expansion of the proposed method to the identification of more species
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Nemertes_Myridaki(chem).pdf2.41 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons