Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/12887
Title: Έκφραση και απομόνωση των ανθρώπινων μεταγραφικών παραγόντων E2F4, E2F5 και TFDP1 για μελέτες μέσω φασματοσκοπίας NMR
Other Titles: Expression and purification of transcription factors E2F4, E2F5 and TFDP1 for NMR Spectroscopy studies
Authors: Μοσχίδη, Δανάη-Καλλιόπη
Keywords: Κυτταρικός κύκλος
Πρωτεΐνη Geminin
Φασματοσκοπία NMR
Keywords (translated): Cell cycle
Geminin
Cdt1
Idas
GemC1
E2F4
E2F5
TFDP1
NMR spectroscopy
Abstract: Ο κυτταρικός κύκλος αποτελεί μία από τις θεμέλιες διαδικασίες για τη βιωσιμότητα του κυττάρου. Η ακρίβεια και η ορθή έκβαση της αντιγραφής του γενετικού υλικού είναι αναγκαία προϋπόθεση για το σωστό πολλαπλασιασμό του κυττάρου. Πιθανά λάθη έχουν ως αποτέλεσμα ποικιλία μεταλλάξεων, οι οποίες οδηγούν σε εκδήλωση κληρονομικών νοσημάτων, διαφόρων μορφών καρκίνου, αλλά και άλλων παθήσεων. Η αδειοδότηση της αντιγραφής είναι καθοριστική για την έναρξη του κυτταρικού κύκλου και πραγματοποιείται κατά μεγάλο βαθμό από την αρνητική ρύθμιση του παράγοντα αδειοδότησης Cdt1. Η πρωτεΐνη Geminin αποτελεί τον φυσικό αναστολέα του παράγοντα αυτού. Εκτός από την πρωτεΐνη αυτή, η υπεροικογένεια Geminin περιλαμβάνει και άλλα δύο μέλη, Idas και GemC1/Lynkeas, τα οποία αποτελούν ορθόλογα της Geminin. Και τα τρία μέλη της οικογένειας αυτής έχουν σημαντικό ρόλο στη «μοίρα» των κυττάρων, καθώς συμμετέχουν καθοριστικά στις διαδικασίες της αντιγραφής και της διαφοροποίησής τους. Η πρωτεΐνη Idas αλληλεπιδρά με τη πρωτεΐνη Geminin με σκοπό να αναστείλει τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των πρωτεϊνών Cdt1 και Geminin και η πρωτεΐνη GemC1 αλληλεπιδρά με το TopBP1 και ρυθμίζει την «στρατολόγηση» του Cdc45 στη χρωματίνη, που αποτελεί σημαντικό παράγοντα για την ενεργοποίηση του προ-αντιγραφικού συμπλόκου της αντιγραφής. Η έναρξη της αντιγραφής του γενετικού υλικού ελέγχεται μέσω της οδού Rb-E2F και ρυθμίζεται αυστηρά από θετικά και αρνητικά σήματα ρυθμιστικής ανάπτυξης. Αρνητικοί ρυθμιστές της κυτταρικής διαίρεσης αποτελούν τα μέλη της οικογένειας «πρωτεϊνών τσέπης» Rb, pRb, p107 και p130, με την πρωτεΐνη pRb να είναι ο ισχυρότερος καταστολέας της οικογένειας και η απορρύθμιση της οποίας οδηγεί σε μία πλειονότητα περιπτώσεων καρκίνου. Τα μέλη της οικογένειας αυτής δεν έχουν την ικανότητα δέσμευσης DNA και ως εκ τούτου διάφορα μέλη των μεταγραφικών παραγόντων E2F είναι απαραίτητα για τη σύνδεσή τους στο DNA. Οι μεταγραφικοί παράγοντες αυτής της οικογένειας σχηματίζουν ετεροδιμερή με έναν από τους δύο μεταγραφικούς παράγοντες DP, με απόρροια την ενίσχυση της πρόσδεσή τους με τις «πρωτεΐνες τσέπης» και το DNA, καθώς και ενισχύεται η διενεργοποίηση των ίδιων των E2Fs. Είναι φανερό ότι είναι αναγκαίος ο προσδιορισμός της μοριακής βάσης και του μηχανισμού αλληλεπίδρασης αυτών των πρωτεϊνών για τη σωστή λειτουργία του κυτταρικού κύκλου. Για αυτό το λόγο, σκοπός αυτής της ερευνητικής εργασίας τέθηκε σε πρώτο στάδιο, ο προσδιορισμός των βέλτιστων συνθηκών έκφρασης των πρωτεϊνών και των συμπλόκων τους και εν συνεχεία η μελέτη της δομής τους μέσω της Φασματοσκοπίας Πυρηνικού Μαγνητικού Συντονισμού (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy – NMR Spectroscopy). Οι πρωτεΐνες, οι οποίες μελετήθηκαν ήταν οι εξής: το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης Lynkeas/GemC1 (GemC1), το καρβοξυτελικό άκρο της πρωτεΐνης Idas (Idas), η περιοχή διμερισμού της πρωτεΐνης E2F4 (ccE2F4), η περιοχή διμερισμού της πρωτεΐνης E2F5 (ccE2F5), η περιοχή διμερισμού της πρωτεΐνης TFDP1 (ccTFDP1) και διευρυμένες περιοχές διμερισμού των πρωτεϊνών E2F5 (exE2F5) και TFDP1 (exTFDP1). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης έδειξαν ότι η έκφραση των πρωτεϊνών ξεχωριστά ως μονομερή αποδείχθηκε δύσκολη με μόνη δυνατότητα έκφρασης σε υψηλά επίπεδα της πρωτεΐνης E2F5, η σταθερότητα της οποίας όμως αποδείχθηκε απαγορευτική για συνέχιση των NMR πειραμάτων. Σύμφωνα με τα ανωτέρω, καταλήγουμε στο συμπέρασμα ότι η περιοχή διμερισμού των πρωτεϊνών E2F4, E2F5 και TFDP1 δεν είναι αρκετή για την έκφραση και την αλληλεπίδρασή τους. Η έκφραση και η απομόνωση βέβαια των πρωτεϊνών με διευρυμένη περιοχή διμερισμού, exE2F5 και exTFDP1 ως μονομερή δεν ήταν ομοίως εφικτή. Ωστόσο, τα επίπεδα έκφρασής τους όταν πραγματοποιήθηκε συνέκφρασή τους στο ίδιο κύτταρο έκφρασης, καθώς και ο χειρισμός τους κατά τη διάρκεια της απομόνωσής τους σαν σύμπλοκο, έθεσε τα θεμέλια για περαιτέρω μελέτη αυτού του συστήματος και καταγραφή NMR φασμάτων. Τέλος, έγινε προσπάθεια προσδιορισμού της αλληλεπίδρασής της πρωτεΐνης GemC1 παρουσία του συμπλόκου exE2F5-exTFDP1 μέσω τιτλοδότησης σε διάφορες αναλογίες. Η συγκέντρωση της πρωτεΐνης GemC1 όμως δεν ήταν ικανοποιητική, ώστε να μπορεί να προκύψει κάποιο ασφαλές συμπέρασμα για τη μετακίνηση των κορυφών στα φάσματα, το οποίο προμηνύει την ύπαρξη αλληλεπίδρασης προσδιορίσιμης μέσω της φασματοσκοπίας NMR.
Abstract (translated): The cell cycle is one of the fundamental processes for cell viability. The accuracy and the correct outcome of the DNA replication is a prerequisite for the proper cell proliferation. Possible mistakes in this process could have as a result a variety of mutations that lead to the manifestation of hereditary diseases, various kinds of cancer and other diseases. The replication licensing is critical for the onset of cell cycle and is largely affected by the negative regulation of the DNA replication factor Cdt1. Geminin is the natural inhibitor of the Cdt1. In addition to this protein, Geminin superfamily includes another two members, Idas and GemC1/Lynkeas, which are orthologues of Geminin. All three members of this family have important role in cell fate as they play a decisive role in the cell proliferation and differentiation. Idas interacts with Geminin to inhibit interactions between the proteins Cdt1 and Geminin, while GemC1 interacts with TopBP1 and regulates the recruitment of Cdc45 to chromatin which is an important in activation of pre-replication complex. The onset of DNA replication is controlled by the Rb-E2F pathway and is strictly regulated by positive and negative growth regulatory signals. Negative cell division regulators are members of pocket protein family Rb, pRb, p107 and p130, and pRb being the most potent suppressor and its deregulation leads to a diverse kind of cancer. Members of this family do not have the ability to bind DNA and therefore various members of transcription factor family E2F are essential for their DNA binding. The transcription factors E2F form heterodimers with one of the two transcription factors DP resulting in enhanced binding to pocket proteins and DNA as well as enhancing the transactivation of the E2Fs themselves. It is obvious that it is necessary to determine the molecular basis and the mechanism of the protein interaction for the proper functioning of cell cycle. The aim of this research was to determine the optimum conditions for the expression of proteins and their complexes and then to study their structure using the Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR). The proteins studied were: the carboxy terminus of GemC1/Lynkeas (GemC1), the carboxy terminus of Idas (Idas), the dimerization site of E2F4 (ccE2F4), the dimerization site of E2F5 (ccE2F5), the dimerization site of TFDP1 (ccTFDP1) and the extended dimerization domains of E2F5 (exE2F5) and TFDP1 (exTFDP1). The results of the present study showed that the expression of the proteins as monomers proved to be difficult with the sole protein which could be expressed in high levels would be the E2F5 protein, but its stability proved to be prohibitive for further NMR experiments. Accordingly, we conclude that the dimerization site of the proteins E2F4, E2F5 and TFDP1 is not sufficient for their expression and interaction. In addition, the expression and isolation of the extended domains exE2F5 and exTFDP1 as monomers was not similarly feasible. However, their expression levels when they were co-expressed and the manipulation during their isolation as a complex, laid the basis for further study of this system and recording NMR spectra. Finally, an attempt was made to determine the interaction of the GemC1 protein in the presence of the exE2f5-exTFDP1 complex by titration in various proportions. However, the concentration of GemC1 was not satisfactory, so that a safe conclusion could be obtained for the displacement of the peaks in the spectra which indicates the existence of an interaction determinable by NMR spectroscopy.
Appears in Collections:Τμήμα Χημείας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Δανάη-Καλλιόπη Μοσχίδη - Master - Ιατρική Χημεία.pdf5.08 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.