Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/378
Title: Συγκριτική μελέτη της έκφρασης των υπομονάδων του GABAA υποδοχέα και των πρώιμων γονιδίων c-fos και zif-268 σε Τομές από τον διαφραγματικό και τον κροταφικό ιππόκαμπο επίμυος πριν καθώς και κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων
Other Titles: Comparative study of GABAA receptor subunits and early genes(c-fos,zif-268)mRNA expression in dorsal and ventral hippocampus before and during the development of the "in vitro sharp waves"
Authors: Σωτηρίου, Ευάγγελος
Issue Date: 2007-06-27T17:55:16Z
Keywords: Κροταφικός ιππόκαμπος
Διαφραγματικός ιππόκαμπος
γ-αμινοβουτιρικό οξύ
Υπομονάδες
Keywords (translated): Dorsal hippocampus
Ventral hippocampus
GABA
Subunits
Septal
Temporal
Abstract: Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της έκφρασης των υπομονάδων του GABAΑ υποδοχέα σε τομές από τον διαφραγματικό και τον κροταφικό ιππόκαμπο αμέσως μετά την θανάτωση του ζώου και κατά την διάρκεια της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων που έχουν παρατηρηθεί μόνο σε τομές του κροταφικού ιππόκαμπου. Επιπλέον, μελετήθηκε η ποσοτική και τοπογραφική κατανομή των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης με την χρήση του ραδιενεργού ιχνηθέτη [3H]-CHA (αγωνιστής των Α1 υποδοχέων) στον κροταφικό και τον διαφραγματικό ιππόκαμπο αμέσως μετά την θανάτωση του επίμυος. Η μελέτη της κατανομής των Α1 υποδοχέων αδενοσίνης έδειξε ότι η δέσμευση της [3H]-CHA ήταν μικρότερη στον κροταφικό σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο με την μεγαλύτερη διαφορά να εντοπίζεται στην CA1 περιοχή. Το παραπάνω αποτέλεσμα έρχεται σε συμφωνία με την υπόθεση, ότι οι συνάψεις του κροταφικού ιππόκαμπου εμφανίζουν μεγαλύτερη πιθανότητα απελευθέρωσης γλουταμινικού οξέος σε σύγκριση με αυτές του διαφραγματικού ιππόκαμπου, καθώς οι Α1 υποδοχέων αδενοσίνης εντοπίζονται στην CA1 περιοχή κυρίως προσυναπτικά όπου ελέγχουν την απελευθέρωση γλουταμινικού οξέος. Στη συνέχεια της παρούσας μελέτης δείξαμε ότι η έκφραση του mRNA και των πρωτεϊνών για τις κυριότερες υπομονάδες του GABAA υποδοχέα είναι διαφορετική μεταξύ του διαφραγματικού και του κροταφικού ιπποκάμπου. Ειδικά, στην CA1 περιοχή του ιπποκάμπου η έκφραση των α1, β2 και γ2 υπομονάδων ήταν μικρότερη, ενώ αντίθετα η έκφραση των α2 και β1 υπομονάδων ήταν μεγαλύτερη στον κροταφικό ιπποκάμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Σύμφωνα με προηγούμενες μελέτες που αφορούν την συνέκφραση των υπομονάδων στο σύμπλοκο του GABAA υποδοχέα τα αποτελέσματα μας υποδηλώνουν ότι ο α1β2 υποτύπος του GABAA υποδοχέα επικρατεί στον διαφραγματικό ιππόκαμπο, ενώ ο α2β1 υπότυπος κυριαρχεί στον κροταφικό ιππόκαμπο. Η διαφορετική κατανομή των υποτύπων στους δυο πόλους του ιπποκάμπου που είναι εντονότερη στην CA1 περιοχή, μπορεί να επηρεάζει τις ιδιότητες του διαύλου (αγωγιμότητα, πλάτος και διάρκεια των IPSCs), δείχνοντας ότι οι υπότυποι του GABAA υποδοχέα που εντοπίζονται στον κροταφικό ιππόκαμπο έχουν μικρότερη ανασταλτική αποτελεσματικότητα, η οποία συμφωνεί με την μικρότερη GABAA-προερχόμενη αναστολή που έχει δειχθεί στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιππόκαμπου. Επιπλέον θα μπορούσε να εξηγήσει την μεγαλύτερη επιρρέπεια του κροταφικού ιππόκαμπου στην επιληψία. Η χαμηλότερη έκφραση του mRNA για τις α4, β3 και δ υπομονάδες του GABAA υποδοχέα στην περιοχή της οδοντωτής έλικας του κροταφικού ιπποκάμπο υποδεικνύει ότι η έκφραση του α4β3δ υποτύπου είναι μικρότερη στον κροταφικό σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Καθώς έχει δειχθεί ότι ο α4β3δ υπότυπος παίζει σημαντικό ρόλο στην τονική αναστολή στα κοκκιώδη κύτταρα της οδοντωτής έλικας, τα παραπάνω αποτέλεσμα μας πιθανώς σημαίνει ότι η τονική αναστολή είναι διαφορετική στους δυο πόλους του ιππόκαμπου. Η αύξηση της έκφρασης του mRNA της α5 υπομονάδας στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιπποκάμπου μπορεί να επηρεάζει την ικανότητα για συναπτική βραχυ- και μακρο-χρόνια πλαστικότητα η οποία έχει βρεθεί να είναι διαφορετική μεταξύ του κροταφικού και του διαφραγματικού ιπποκάμπου καθώς έχει δειχθεί ότι οι α5-υπότυποι παίζουν ρόλο σε διαδικασίες μνήμης και μάθησης. Επίσης, οι α5-υπότυποι του GABAA υποδοχέα στην CA1 περιοχή του ιππόκαμπου συμμετέχουν στην τονική αναστολή. Τα υψηλότερα επίπεδα στην έκφραση του mRNA για την α5 υπομονάδα στον κροταφικό ιππόκαμπο σε σύγκριση με τον διαφραγματικό ιππόκαμπο πιθανώς υποδεικνύουν ότι η τονική αναστολή είναι διαφορετική στην CA1 περιοχή των δυο πόλων του ιππόκαμπου. Στο δεύτερο μέρος της παρούσας διατριβής μελετήσαμε την πιθανή συσχέτιση του GABAεργικού συστήματος με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων η οποία έχει παρατηρηθεί, σε κανονικές "in vitro" συνθήκες, μόνο σε τομές του κροταφικού ιππόκαμπου. Για το λόγο αυτό πραγματοποιήσαμε αναλυτική μελέτη της έκφρασης του mRNA των υπομονάδων (α1, α2, α5, β1, β2, β3, γ2) του GABAΑ υποδοχέα σε διάφορα χρονικά διαστήματα κατά την κανονική "in vitro" διατήρηση των τομών (15min, 1, 3, 5 και 8h). Αρχικά μελετήσαμε την έκφραση των πρώιμων γονιδίων (c-fos, zif-268), που είναι δείκτες της νευρωνικής ενεργότητας, μετά από 5 ώρες κανονικής "in vitro" διατήρησης των τομών με σκοπό τη πιθανή συχέτιση της έκφρασης τους με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων. Τα αποτελέσματα μας έδειξαν και στους δυο πόλους του ιπποκάμπου παρόμοια αύξηση της έκφρασης του mRNA τόσο για το c-fos όσο και για zif-268 γεγονός που υποδηλώνει ότι γονιδιακή ενεργότητα είναι παρόμοια και όσο αφορά τα συγκεκριμένα πρώιμα γονίδια ανεξάρτητη της ανάπτυξης των "in vitro" οξέων κυμάτων. Στην CA1 περιοχή του κροταφικού ιππόκαμπου παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της έκφρασης του mRNA των α1, β2 και γ2 υπομονάδων του GABAΑ υποδοχέα η οποία ξεκινάει την 1η ώρα, δηλαδή πριν την οργανωμένη εμφάνιση της αυθόρμητης δραστηριότητας, γίνεται μέγιστη στις 4 ώρες παραμονής των τομών σε Τεχνητό Εγκεφαλονωτιαίο Υγρό (ΤΕΝΥ) και συμβαδίζει χρονικά με την οργάνωση των "in vitro" οξέων κυμάτων. Δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές αλλαγές σε τομές που προέρχονται από τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Έχει δειχθεί ότι οι α1-υπότυποι παίζουν σημαντικό ρόλο στην ανασταλτική ικανότητα του υποδοχέα. Επίσης η παρουσία της β2 υπομονάδας στον δίαυλο χαρακτηρίζει μεγαλύτερα σε πλάτος και διάρκεια ανασταλτικά ρεύματα συγκρινόμενη με τις β1 υπομονάδες. Φαίνεται λοιπόν ότι ο υπότυπος α1β2γ2, του οποίου η έκφραση αυξάνει πριν την έναρξη της οργανωμένης ρυθμικής δραστηριότητας, λόγω της συγκρότησης του από τις συγκεκριμένες υπομονάδες, έχει μεγάλη ανασταλτική αποτελεσματικότητα η οποία μπορεί να συμμετέχει στην ανάπτυξη των "in vitro" οξέων κυμάτων. Η δέσμευση της [3H]–muscimol αυξάνει σε τομές που προέρχονται μόνο από τον κροταφικό ιππόκαμπο και έχουν παραμείνει σε κανονικές "in vitro" συνθήκες για 8 ώρες σε σύγκριση με αντίστοιχες τομές που προέρχονται αμέσως μετά την θανάτωση του ζώου. Καμία αλλαγή δεν παρατηρήθηκε στην δέσμευση της [3H]–muscimol σε τομές που προέρχονται από τον διαφραγματικό ιππόκαμπο. Η αύξηση της δέσμευσης της [3H]–muscimol μόνο στις τομές που προέρχονται από τον κροταφικό ιππόκαμπο είναι σε συμφωνία με την αύξηση της έκφρασης του α1β2γ2-υποτύπου καθώς έχει δειχθεί ότι η θέση δέσμευσης της muscimol στο δίαυλο του GABAA υποδοχέα είναι μεταξύ των α1 και β2 υπομονάδων. Συμπερασματικά, η εκλεκτική αύξηση της έκφρασης του α1β2γ2-υπότυπου μόνο στην CA1 περιοχή του κροταφικού δηλώνει μεγαλύτερη ανασταλτική αποτελεσματικότητα των GABAA υποδοχέων, δεδομένου ότι ο α1β2γ2-υπότυπος προκαλεί μεγαλύτερα ανασταλτικά μετασυναπτικά ρεύματα. Το παραπάνω μπορεί να σχετίζεται με την "in vitro" εμφάνιση των οξέων κυμάτων καθώς η αυθόρμητη δραστηριότητα προέρχεται από GABAA-επαγόμενες υπερπολώσεις των πυραμιδικών κυττάρων, ενώ και η αύξηση στην έκφραση του α1β2γ2-υποτύπου συμπίπτει χρονικά με την εμφάνιση των "in vitro" οξέων κυμάτων.
Abstract (translated): The hippocampus in the rat appears grossly as an elongated structure with its long axis bending in a C-shaped manner from the septal nuclei rostrodorsally to the incipient temporal lobe caudoventrally. The long axis of the hippocampal formation is referred as the dorsoventral axis. Although hippocampus has been traditionally thought as a homogeneous structure, several studies have been demonstrated differences at several organization levels (from the behavioural to the cellular) between its dorsal (DH) and ventral (VH) pole. In the present study, we examined whether the recently reported differences in the GABA-mediated somatic inhibition between the DH and VH could be related to variations in the GABAA receptors. We therefore studied the quantitative distribution, the kinetic parameters and the subunit composition of the GABAA receptors in the two parts of hippocampus. We also studied the A1 adenosine receptors in order to examine the involvement of the adenosinergic system in the glutamate release between the two hippocampal poles. The study of [3H]-CHA binding on A1 adenosine receptors by using "in vitro" quantitative autoradiography, revealed a weaker A1 receptor binding in VH compared to DH in all regions we examined. Taken into consideration that the A1 adenosine receptors are localized in the CA1 glutamatergic terminals, these results may to some extend explain our hypothesis that synapses in the VH have greater probability of glutamate release compared to those in the DH counterpart. Recent data have demonstrated a weaker somatic GABAergic inhibition in CA1 region of VH compared to DH. We therefore examined possible differences in the GABAA receptor subunit composition and receptor binding parameters between DH and VH by using "in situ" hybridization, western blotting and the specific binding of the GABAA receptor agonist [3H]-muscimol using quantitative autoradiography and saturation experiments. The experiments demonstrated that the VH compared to DH displayed: 1) lower levels of mRNA expression for α1, β2, γ2 but higher levels for α2 and β1 subunits in CA1, CA2 and CA3, with the differences being more pronounced in CA1 region. Western blot analysis confirmed the mRNA expression data, showing lower levels for α1, β2 and higher levels for α2 subunits’ protein. Only in the CA1 region the mRNA levels of α5 were higher, while those of α4 subunit were slightly lower; in dentate gyrus, the mRNA levels of α4, β3 and δ subunits were significantly lower in VH compared to DH presumably suggesting a lower expression of the α4/β3/δ receptor subtype; 2) lower levels of [3H]-muscimol binding in the VH, with the lowest value observed in CA1, apparently resulting from weaker affinity for GABA and not from a decreased receptor density, since the KD values were higher in VH, while the Bmax values were similar between DH and VH. In conclusion, the differences in the subunit mRNA and protein expression and the lower affinity of GABAA receptor observed predominantly in CA1 region of VH, suggest that the α1 subunit-containing GABAA receptors dominate in the DH, while the α2 subunit-containing receptors prevail in VH. This could underlie the lower GABAA mediated somatic inhibition observed in VH and, to some extent, explain: a) the higher liability of VH for epileptic activity and b) the differential involvement of DH and VH in cognitive and emotional processes. Recent electrophysiological experiments have been shown that slices from the VH of adult rats generate rhythmical activity during their maintenance in the recording chamber. This activity is fully organized during the first 3 hours of in vitro maintenance and resembles the in vivo recorded hippocampal "sharp waves", therefore called "in vitro sharp waves". The field manifestation of this spontaneous activity results from GABAA receptor-mediated hyperpolarizations in pyramidal cells. The aim of the second part of the present thesis focused on the possible relationship between the characteristics of GABAA receptors and the development of "in vitro sharp waves". Using the "in situ hybridisation" technique, we examined the mRNA expression of the alpha1/2/5,beta1/2/3 and gamma2 subunits of GABAA receptor and the binding of GABAA receptor agonist [3H]-muscimol in a time course including periods before and during the development of the "in vitro sharp waves". Six sets of transversely cut DH and VH slices were prepared: slices frozen immediately after killing the animal (naive slices), and slices maintained in vitro and frozen at different time points (15min, 1, 3, 5 and 8h) during the electrophysiological experiment. The results showed: A) Upregulation of alpha1, beta2 and gamma2 subunits mRNA in VH but not in DH slices at 1h of their maintenance, which became significant at 3h as compared to the respective naive slices; B) Increase in [3H]-muscimol binding only in VH slices, obtained at 8h compared to the respective naive ones. The upregulation of the α1β2γ2 GABAA receptor subtype (starting at 1h) in VH but not in DH presumably suggests an increase in GABAergic activity, which could be related with the appearance of "in vitro sharp waves" observed only in VH; C) Τhe similar mRNA expression of the early genes c-fos and zif-268 in the two hippocampal poles showing a comparable general gene activity in DH and VH. In conclusion, the α1β2γ2 subtype dominates in DH while the α2β2-subtype prevails in VH and this could be related to the weaker somatic inhibition observed in the CA1 region of VH, and also to the distinct involvement of DH and VH in cognitive and emotional processes. Moreover, the higher expression of the GABAA receptor subtype α4β4δ in the DG of DH compared to VH may imply a higher tonic inhibition in the former hippocampal pole. The upregulation of the α1β2γ2- subtype only in VH slices during their in vitro maintenance may reflect an increase in the impact of GABAA receptor-mediated transmission, which is required for the organization of "in vitro" sharp waves.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
163.pdf4.21 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.