Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/3823
Title: Συμβολή στον χαρακτηρισμό και στη διερεύνηση βιολογικών ιδιοτήτων των στύλων ειδών γένους Crocus
Authors: Χρυσάνθη, Δήμητρα
Issue Date: 2010-10-20T05:49:33Z
Keywords: Κρόκος
Καρκίνος
Keywords (translated): Crocus
Cancer
MMPs
Abstract: Ανάμεσα στα διάφορα είδη του γένους Crocus, ο C. sativus έχει μελετηθεί εκτενώς ως προς τη σύσταση και τις βιολογικές ιδιότητες των στύλων του, οι οποίοι αποτελούν το γνωστό άρτυμα (κρόκος ή ζαφορά) το οποίο χρησιμοποιείται ευρέως στη Μεσογειακή, την Ινδική και την Κινέζικη μαγειρική. Ανά τους αιώνες, στον κρόκο έχουν αποδοθεί πολλές θεραπευτικές ιδιότητες. Παρά την ύπαρξη πολλών μελετών, οι οποίες αναφέρουν ότι η κροκετίνη και οι κροκίνες από τον κρόκο έχουν ποικίλες βιολογικές δράσεις, θέματα που αφορούν στον τρόπο χορήγησης του κρόκου καθώς και στην απορρόφηση και στο μεταβολισμό των καροτενοειδών του σε ανθρώπους δεν έχουν ακόμα απαντηθεί. Στην παρούσα μελέτη, ισοκρατική μέθοδος υγρής χρωματογραφίας ανάστροφης φάσης αναπτύχθηκε και επικυρώθηκε για την ανίχνευση κροκετίνης σε πλάσμα. Τα αποτελέσματα έδειξαν υψηλή συγκέντρωση της κροκετίνης μετά από 2 ώρες (1.24 -3.67 μΜ) και παρουσία της ακόμα και στις 24 ώρες (0.10-0.24). Ενδιαφέρον προκαλεί η παρουσία του cis-ισομερούς σε ποσοστά 25 με 50%, προτείνοντας in vivo ισομερείωση. Με χρήση υγρής χρωματογραφίας (HPLC) και UV/vis φασματοσκοπίας δείχνουμε για πρώτη φορά την παρουσία υδρόφιλων καροτενοειδών στους στύλους τριών ενδημικών ειδών Crocus: C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi και C. niveus και ότι στα ενδημικά είδη η αλκαλική υδρόλυση οδηγεί σε ένα άγλυκο trans-καροτενοειδές. Με σκοπό την περαιτέρω έρευνα ως προς την επίδραση των μεθανολικών εκχυλισμάτων αλλά και συστατικών του saffron στον πολλαπλασιασμό καρκινικών κυττάρων του μαστού, εφόσον ο καρκίνος του μαστού αποτελεί κύρια αιτία θανάτου σε γυναίκες, χρησιμοποιήσαμε τις κυτταρικές σειρές MCF-7 και MDA-MB-231 ενώ μετρήθηκε και η επίδραση στην διηθητικότητα της κυτταρικής σειράς MDA-MB-231. Μετά από επώαση 24 ωρών, η κροκετίνη ανέστειλε σημαντικά όχι μόνο τον πολλαπλασιασμό αλλά επίσης την διήθηση, στις συγκεντρώσεις 1 και 10 μM. Μελέτες όσον αφορά στις μοριακές αλλαγές στην έκφραση των MMPs και των TIMPs, έδειξαν σημαντική μείωση στη γονιδιακή και πρωτεϊνική έκφραση των MT1-MMP και MT2-MMP και των ζελατινασών.
Abstract (translated): Among the different species of Crocus, only C. sativus has been extensively studied for the composition and the biological properties of its styles, since these constitute the well-known spice saffron, which is widely used in the Mediterranean, Indian and Chinese diet. Throughout centuries, saffron is attributed with many therapeutic uses. Crocetin is a carotenoid dicarboxylic acid, which in nature is esterified with glucose or gentiobiose units forming the crocins, abundant components of saffron (a spice with many reputed medicinal uses). Although studies have demonstrated that crocetin and crocins from saffron have various biological functions, issues concerning the route and way of saffron administration, the absorption and metabolism of saffron carotenoids in humans have not been answered yet. In the present study, an isocratic reversed-phase liquid chromatographic method was developed and validated for the determination of crocetin in plasma. Samples were pre-treated by solid phase extraction (recoveries >72%) and were chromatographed on a Luna C-18 column (4.6 mm x 250 mm, 5 μm) with a mobile phase consisting of methanol/water/trifluoroacetic acid (75.0/24.5/0.5, % v/v/v) at a flow rate of 1.0 mL min-1. The HPLC method developed resulted in sharp peaks at 10.7 (trans-crocetin) and 18.6 min (cis-crocetin), whereas the calibration curve of total crocetin in plasma displayed a good linearity for concentrations of 0.020 to 20 μΜ (R2=0.999). Specificity, precision, accuracy and stability were also studied with spiked plasma samples and were acceptable. The developed method was applied to the determination of crocetin levels in plasma of four healthy human volunteers before and after consumption of one cup of saffron infusion (200 mg of saffron in water 80°C for 5 min). Results showed that the concentration of crocetin was high after 2h (1.24 -3.67 μΜ) and still determined after 24 h (0.10-0.24). Interestingly, the percentage of the cis-isomer ranges from 25 to 50%, suggesting in vivo isomerization. With high performance liquid chromatography (HPLC) and UV/vis spectroscopy we show for the first time, the presence of hydrophilic carotenoids in the styles of three other Crocus taxa, endemic in Greece: C. boryi ssp. tournefortii, C. boryi ssp. boryi and C. niveus. In order to investigate the effect of the methanolic extracts and the constituents of saffron on breast cancer cell proliferation, since breast cancer is a major cause of death among women, we used the cell lines MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Incubation for 24 and 48 h showed an inhibitory effect on cell proliferation. Studies on the effect of constituents of C. sativus styles showed that the antiproliferative effect is mainly attributed to crocetin. In order to further study the effect of crocetin, the active metabolite of crocins, on breast cancer cells, we used the highly invasive MDA-MB-231 cells and measured the viability with the WST-1 assay and the invasiveness through a reconstituted basement membrane. After 24 h incubation, crocetin inhibited not only proliferation but also invasion significantly at the physiological relevant concentrations of 1 and 10 μM. Studies in the molecular changes of expression of MMPs and their endogenous inhibitors (TIMPs), were performed following reversed transcription and polymerase chain reaction, whereas protein expression and gelatinolytic activity were determined with Western blotting and zymography. The gene and protein expression of MT1-MMP and MT2-MMP were greatly attenuated by both crocetin and all-trans-retinoic acid (ATRA, used as control). Incubation with 10 μM crocetin for 24 h in serum free conditions reduced pro-MMP-9 levels, whereas when cultured in media with sera 2 and 5%, it also reduced gelatinase protein expression. Crocetin and ATRA also upregulate TIMP-1 and TIMP-3 mRNA expression and downregulate TIMP-2 expression.
Appears in Collections:Τμήμα Φαρμακευτικής (ΔΔ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
PhD.pdf6.01 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.