Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/5272
Title: Γονιδιωματικές και λειτουργικές μελέτες επί ανθρώπινων αποαδενυλασών
Authors: Αναστασάκης, Δημήτριος
Issue Date: 2012-05-30
Keywords: Αποαδενυλάση
πολυ(Α)
Keywords (translated): Deadenylase
poly(A)
Abstract: Η αποαδενυλίωση είναι συνήθως στάδιο που καθορίζει το ρυθμό της αποικοδόμησης και καταστολής της μετάφρασης του mRNA. Το γεγονός αυτό καθιστά την αποαδενυλίωση ως το κυριότερο σημείο ελέγχου για τις δύο αυτές διαδικασίες. Οι αποαδενυλάσες είναι εξωριβονουκλεάσες εξαρτώμενες από Mg2+ που υδρολύουν το mRNA με κατεύθυνση 3’-5’, παράγοντας 5’-AMP. Ο αριθμός των γνωστών αποαδενυλασών έχει επεκταθεί πρόσφατα, κυρίως μέσω βιοχημικών και γενετικών μελετών. Όλες οι γνωστές αποαδενυλάσες ανήκουν σε μία από της δύο ομάδες, την DEDD ή την exonuclease– endonuclease–phosphatase (EEP) υπέρ-οικογένεια. ∆εν είναι ακόμη πλήρες κατανοητό το πλεονέκτημα της ύπαρξης τόσων πολλών αποαδενυλασών. Υποψήφιες αποαδενυλάσες έχουν ταυτοποιηθεί με χρήση προγραμμάτων βιοπληροφορικής, ωστόσο η δράση τους δεν έχει αποδειχθεί, όπως η PNLDC1. Αρχική βιοπληροφορική ανάλυση του γονιδίου pnldc1 έδειξε ότι κωδικοποιεί μια πρωτεΐνη η οποία παρουσιάζει ομολογία με την PARN με πετιδικό σήμα που σχετίζεται με μια διαμεμβρανική περιοχή της πρωτεΐνης. Επιπρόσθετα φαίνεται ότι ο υποκινητής του γονιδίου περιέχει νησίδες CpG. Με μοντελοποίηση με βάση την ομολογία με την ανθρώπινη PARN της περιοχής με δράση νουκλεάσης προβλέφθηκε μία δομή που περιέχει ενεργό κέντρο με τα χαρακτηριστικά κατάλοιπα DEDD να κατευθύνονται σωστά για να αλληλεπιδρούν με τα ιόντα Mg2+ και να υποστηρίζουν ενζυμική δράση. Το γονίδιο pnldc1 κλωνοποίηθηκε και η ανασυνδυασμένη πρωτεΐνη καθαρίσθηκε με χρωματογραφία συγγένειας. Πειράματα αποαδενυλίωσης έδειξαν ότι η PNLDC1_1 είναι μία αποαδενυλάση με υψηλή συγγένεια γα το υπόστρωμα poly(A) αλλά χαμηλή Vmax σε σχέση με την PARN. Η έκφραση του pnldc1 μπορεί να ρυθμιστεί μέσω μεθυλίωσης του υποκινητή. Ύστερα από χορήγηση του απομεθυλιωτικού 5-Aza- Deoxycytidine, η έκφραση του pnldc1 αυξήθηκε 4 φορές στις κυτταρικές σειρές HaCaT και HEK 293 T ενώ τα επίπεδα των PARN και CNOT7 mRNA παρέμειναν αμετάβλητα, υποδεικνύοντας πιθανόν έναν μοναδικό ρόλο της νέας αποαδενυλάσης στην γονιδιακή έκφραση κατά την διάρκεια της εμβρυογένεσης και διαφοροποίησης. Η αποαδενυλάση PAN2 είναι μέλος της οικογένειας των DEDD νουκλεασών και ξεκινάει την βράχυνση του poly(A) απομακρύνοντας σχεδόν την μισή ουρά μέχρι άλλες αποαδενυλάσες να αποικοδομούν την υπόλοιπη. Παρόλο που ο ρόλος της PAN2 στην αποικοδόμηση του mRNA είναι διευκρινισμένος ο βιολογικός ρόλος του ενζύμου δεν έχει αποσαφηνισθεί. Μετά από αποσιώπηση της PΑΝ2 παρατηρήθηκε σημαντική μείωση στα επίπεδα έκφρασης των mRNA PARN, Papola, CBP20 και MYC ενώ δεν παρατηρήθηκε σημαντική αλλαγή στα επίπεδα EIF4E και CNOT7. Τα αποτελέσματα μας υποδεικνύουν ότι η PAN2 εμπλέκεται στην γονιδιακή έκφραση πιθανόν με το να διεγείρει την αποικοδόμηση των ήδη υπαρχόντων μορίων mRNA επιτρέποντας την παραγωγή νέων.
Abstract (translated): Deadenylation is often a rate-limiting step for mRNA decay and translational silencing, making it an ideal control point for both processes. Deadenylases are Mg2+ -dependent exoribonucleases that hydrolyse RNA in the 3′→5′ direction, which results in release of 5′- AMP. The number of known deadenylases has recently expanded, mainly through biochemical and genetics studies. All known deadenylases belong to one of two groups, the DEDD or the exonuclease–endonuclease–phosphatase (EEP) superfamilies. The advantage of having such a range of deadenylases is not yet completely understood. Putative deadenylases have been identified through bioinformatics, but their functions has not yet been established such as the mammalian PNLDC1 which is a Poly(A)-specific Ribonuclease homolog (termed PARN-like). Preliminary bioinformatic analysis of the pnldc1 gene revealed that it encodes a PARN-similar protein with a signal peptide which corresponds to a trans-membrane region. In addition several CpG islands within the gene’s promoter were identified. Homology modeling of the nuclease domain with its human PARN homolog predicted a structure that forms an active site which contains the characteristic DEDD residues orientated correctly to interact with Mg2+ ions to support enzymatic activity. Pnldc1 was cloned and the recombinant protein was purified via affinity chromatography. Deadenylation assays showed that PNLDC1_1 is a deadenylase with high affinity for poly(A) substrates but relatively low Vmax compared to PARN. Interestingly, pnldc1 expression can be regulated through promoter methylation. Following treatment with the demethylating agent, 5-Aza-Deoxycytidine, pnldc1 expression was increased 4-fold in both HaCaT and HEK 293 T cell lines, whereas PARN and CNOT7 mRNA expression was unchanged, thus implying a possible unique role of this new deadenylase in gene expression during embryogenesis and differentiation. PAN2 deadenylase, a member of the DEDD nucleases initiates poly(A) degradation removing almost half of the tail when other nucleases degrade the rest of the tail. Although the role of PAN2 in mRNA degradation has been revealed, its biologic function has not been studied. On knockdown of PAN2 a significant reduction was observed in the levels of PARN, Papola, CBP20 and MYC, but no significant change changes were observed in the levels of EIF4E and CNOT7 mRNA expression. Our results indicate that PAN2 is involved in gene expression, this probably by triggering the degradation of the current messengers allowing production of new messengers.
Appears in Collections:Τμήμα Ιατρικής (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
MASTER.pdf2.83 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.