Please use this identifier to cite or link to this item: http://hdl.handle.net/10889/8993
Title: Επίδραση της οξείας και χρόνιας χορήγησης του κανναβινοειδικού αγωνιστή WIN55,212-2 στην κατανομή των CB1 και D2 υποδοχέων στον εγκέφαλο επιμυός
Authors: Τσαρούχη, Μάρθα
Keywords: CB1 υποδοχείς
Οξεία χορήγηση
Χρόνια χορήγηση
D2 υποδοχείς
Keywords (translated): WIN55,212-2
CB1 receptors
Acute administration
Chronic administration
D2 receptors
Abstract: Το ενδογενές σύστημα των κανναβινοειδών αποτελείται από τους υποδοχείς των κανναβινοειδών, τα ενδοκανναβινοειδή καθώς και τα ένζυμα που συμμετέχουν στη σύνθεση και στην αποικοδόμηση των ενδοκανναβινοειδών. Αποτελεί ένα πολύπλοκο ενδογενές σύστημα μεταγωγής σήματος το οποίο επηρεάζει ένα σημαντικό αριθμό φυσιολογικών διεργασιών του οργανισμού, αλληλεπιδρώντας με διάφορα νευροδιαβιβαστικά συστήματα. Κύρια λειτουργία του ενδογενούς συστήματος των κανναβινοειδών αποτελεί η ρύθμιση της συναπτικής διαβίβασης σε διεγερτικές και ανασταλτικές οδούς του εγκεφάλου. Ιδιαίτερης σημασίας είναι η στενή σύνδεση που εμφανίζει το ενδογενές σύστημα των κανναβινοειδών με το ντοπαμινεργικό σύστημα. Πιο συγκεκριμένα, η Δ9 τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC), το κύριο δραστικό συστατικό του φυτού της κάνναβης, έχει δειχθεί ότι επάγει την απελευθέρωση ντοπαμίνης στο ραβδωτό σώμα επίμυων αλλά και ανθρώπων. Σε παρόμοια συμπεράσματα καταλήγουν και μελέτες έπειτα από συστηματική χορήγηση εξωγενών κανναβινοειδικών αγωνιστών, καθώς και έπειτα από χορήγηση ενδογενών κανναβινοειδών απουσία ή παρουσία αναστολέων του ενδοκανναβινοειδικού καταβολισμού. Επιπρόσθετα, το ενδοκανναβινοειδικό σύστημα έχει υποτεθεί ότι λειτουργεί ως φραγμός πάνω στην μη φυσιολογική συμπεριφορά που συνδέεται με την ντοπαμινεργική υπερενεργοποίηση. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να ερευνηθεί ο τρόπος με τον οποίο η οξεία ή χρόνια χορήγηση του κανναβινοειδικού αγωνιστή WIN55,212-2 επιδρά στη κατανομή των CB1 υποδοχέων των κανναβινοειδών και των D2 υποδοχέων της ντοπαμίνης. Στο μοντέλο της χρόνιας χορήγησης μελετήθηκαν επιπλέον ομάδες πειραματοζώων οι οποίες αφού έλαβαν χρονίως τον αγωνιστή απείχαν της χορήγησης για διαστήματα επτά και 20 ημερών. Μελετήσαμε έτσι την έκφραση των ανωτέρω υποδοχέων (CB1 υποδοχείς, D2 υποδοχείς) στο εγκέφαλο αρσενικών ενηλίκων επίμυων, σε περιοχές που εμπλέκονται στην ανταμοιβή, την αντιμετώπιση του στρες, τη μνήμη, τη μάθηση, τον έλεγχο των κινήσεων και το συναίσθημα όπως ο προμετωπιαίος φλοιός, το ραβδωτό σώμα, η μέλαινα ουσία και ο ιππόκαμπος. Σύμφωνα με το παρόν πρωτόκολλο, στο μοντέλο της χρόνιας χορήγησης δημιουργήθηκαν τρεις ομάδες επίμυων στους οποίους πραγματοποιήθηκε χορήγηση του κανναβινοειδικού αγωνιστή WIN55,212-2 σε συγκέντρωση 1 mg/kg, μία φορά την ημέρα για 20 ημέρες. Οι επίμυες της 1ης ομάδας θανατώθηκαν 2 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση, ενώ αυτοί της 2ης και της 3ης θανατώθηκαν 7 και 20 μέρες μετά τη τελευταία χορήγηση, αντίστοιχα. Ο πειραματικός αυτός σχεδιασμός επιλέχθηκε προκειμένου να μελετηθεί εάν και σε πιο βαθμό οι πιθανές μεταβολές διατηρούνται και έπειτα από τη διακοπή της χορήγησης του συγκεκριμένου αγωνιστή. Για τη διερεύνηση της επίδρασης της οξείας χορήγησης του αγωνιστή WIN55,212-2, δημιουργήθηκαν τρεις ακόμη ομάδες επίμυων, όπου στην πρώτη πραγματοποιήθηκε χορήγηση του WIN55,212-2 (1 mg/kg), η δεύτερη ομάδα είναι ομάδα ελέγχου (δηλαδή έλαβε το έκδοχο), ενώ στα υποκείμενα της τρίτης ομάδας, της χορήγησης του WIN55,212-2, προηγήθηκε η χορήγηση του ανταγωνιστή των CB1 υποδοχέων ΑΜ251. Και οι τρεις ομάδες πειραματοζώων θανατώθηκαν 2 ώρες μετά την τελευταία χορήγηση. Χρησιμοποιήθηκε η τεχνική του υβριδισμού in situ για τη εντόπιση και ποσοτικοποίηση των επιπέδων mRNA των υποδοχέων CB1 και D2, η μέθοδος της ποσοτικής αυτοραδιογραφίας in vitro για τη μέτρηση των επιπέδων δέσμευσης του CB1 υποδοχέα και η ανοσοαποτύπωση κατά Western για τον προσδιορισμό των πρωτεϊνικών επιπέδων των D2 υποδοχέων. Τα αποτελέσματα της έρευνας έδειξαν ότι η χορήγηση του υπό μελέτη αγωνιστή προκάλεσε μεταβολές στην έκφραση των υποδοχέων CB1, με τρόπο ειδικό σε κάθε περιοχή και διαφορετικό μεταξύ οξείας και χρόνιας χορήγησης. Πιο συγκεκριμένα, ενήλικοι επίμυες που έλαβαν μια φορά τον κανναβινοειδικό αγωιστή WIN55,212-2 παρουσιάζουν αυξημένα mRNA επίπεδα του CB1 στην περιοχή του προμετωπιαίου φλοιού, σε αντίθεση με επίμυες που λάμβαναν επί 20 ημέρες τον αγωιστή και οι οποίοι παρουσιάζουν αμετάβλητα τα εν λόγω επίπεδα mRNA. Στην ίδια περιοχή ουδεμία μεταβολή παρατηρείται στα επίπεδα δέσμευσης του CB1 και στα δύο πειραματικά μοντέλα. Στην περιοχή του ραβδωτού σώματος παρατηρείται μείωση τόσο των επιπέδων mRNA καθώς επίσης και αυτών της δέσμευσης του CB1 κατά την οξεία αλλά και κατά τη χρόνια χορήγηση του αγωνιστή. Είναι ιδιαιτέρως σημαντικό να τονιστεί πως τα επίπεδα δέσμευσης του CB1 φαίνεται να επανέρχονται στα επίπεδα της ομάδας ελέγχου έπειτα από επταήμερη διακοπή της χορήγησης. Από την άλλη, τα επίπεδα mRNA του CB1 παρουσιάζουν κι αυτά επαναφορά στα επίπεδα ελέγχου αφού όμως παρέλθει περίοδος είκοσι ημερών κατά την οποία τα πειραματόζωα δε λάμβαναν τον αγωνιστή. Ανάλογα είναι τα αποτελέσματά μας που αφορούν στη συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας. Κατά την οξεία χορήγηση, τα επίπεδα δέσμευσης του CB1 παρουσιάζονται αμετάβλητα μεταξύ των ομάδων των υποκειμένων. Ωστόσο, τα ανωτέρω επίπεδα παρουσιάζονται μειωμένα στα πειραματόζωα που λάμβαναν τον αγωνιστή για είκοσι ημέρες. Επτά ημέρες αποχής από τη λήψη του WIN55,212-2 φαίνεται ότι αρκούν ώστε οι τιμές τους να επανέλθουν στα φυσιολογικά επίπεδα. Επιπρόσθετα, κατά την οξεία χορήγηση σημειώνονται μειωμένα επίπεδα mRNA στην οδοντωτή έλικα του ιπποκάμπου, ενώ τα επίπεδα αυτά δεν επηρεάζονται στη CA1 και CA3 περιοχή. Μελετώντας την επίδραση της χρόνιας χορήγησης παρατηρήσαμε αυξημένα επίπεδα mRNA του υποδοχέα μόνο στη CA1 περιοχή. Τέλος, όσον αφορά το ντοπαμινεργικό σύστημα, διαπιστώθηκαν αυξημένα επίπεδα mRNA της D2L ισομορφής του D2 υποδοχέα στη συμπαγή μοίρα της μέλαινας ουσίας και το κοιλιακό καλυπτρικό πεδίο στους ενήλικους επίμυες που λάμβαναν τον κανναβινοειδικό αγωνιστή για είκοσι ημέρες. Επταήμερη διακοπή της χορήγησης αρκεί ούτως ώστε τα ανωτέρω επίπεδα να επανέλθουν σε φυσιολογικές τιμές. Στην περιοχή του ραβδωτού σώματος, η χρόνια χορήγηση του αγωνιστή δεν προκάλεσε στατιστικά σημαντική μεταβολή των πρωτεϊνικών επιπέδων του D2 υποδοχέα της ντοπαμίνης. Συμπερασματικά, οι μεταβολές στην έκφραση των υποδοχέων CB1 και D2 θεωρούμε ότι συντελούνται μέσω γονιδιακής ρύθμισης η οποία ενδεχομένως συμβαίνει τόσο σε μεταγραφικό, σε μεταφραστικό αλλά και σε μετα-μεταφραστικό επίπεδο. Η ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης είναι ένας μηχανισμός που μπορεί να προκαλέσει σχετικά μόνιμες αλλαγές στους νευρώνες. Η χρόνια χορήγηση εξαρτησιογόνων ουσιών μπορεί να προκαλέσει τέτοιες αλλαγές στον πυρήνα του νευρώνα, ώστε να προκληθούν μεταβολές στο ρυθμό μεταγραφής συγκεκριμένων γονιδίων, να μεταβληθεί η ενδοκυττάρια μετάδοση σήματος και να διαταραχθεί η κυτταρική επικοινωνία στον εγκέφαλο. Τα ανωτέρω θα έχουν ως αποτέλεσμα μεταβολές στη συμπεριφορά.
Abstract (translated): The endogenous cannabinoid system consists of cannabinoid receptors, endocannabinoids and enzymes involved in the synthesis and degradation of endocannabinoids. It is a complex endogenous signal transduction system that affects a significant number of physiological processes of the organism, interacting with various neurotransmitter systems. Its main function is to regulate synaptic transmission at excitatory and inhibitory pathways in the brain. The endogenous cannabinoid system shows close connection with the dopaminergic system. Specifically, Δ9-tetrahydrocannabinol (Δ9-THC), the main psychoactive constituent of cannabis has been shown to induce the release of dopamine in the striatum of rats and humans. The endocannabinoid system has been postulated to function as a barrier on abnormal behavior associated with dopaminergic hyperactivation. The purpose of this study was to investigate the way in which acute and chronic administration of the cannabinoid agonist WIN55,212-2 affects the distribution of CB1 cannabinoid receptor and D2 dopamine receptors. In the model of chronic administration we studied additional groups of laboratory animals which after receiving the agonist chronically abstained from administration for seven and twenty days, respectively. We studied the expression of these receptors (CB1 receptors, D2 receptors) in the brain of adult male rats at regions involved in reward, deal with stress, memory, learning, motor control and emotion as the prefrontal cortex, the striatum, substantia nigra and the hippocampus. According to this protocol, in the model of chronic administration we generated three groups of rats who were administered the cannabinoid agonist WIN55,212-2 at a concentration of 1 mg/kg, once a day for 20 days. The rats of the first group were sacrificed two hours after the last injection, while those of the second and third were sacrificed 7 and 20 days after the last administration, respectively. The experimental design was chosen in order to consider whether and to what extent possible changes are maintained after the discontinuation of the agonist administration. In order to investigate the effect of acute administration of WIN55,212-2, we created three groups of rats, where the first was administered a single dose of WIN55,212-2 (1 mg / kg), the second group is the control group (i.e. received vehicle), while subjects in the third group received an injection of CB1 antagonist AM251 before the administration of WIN55,212-2. All three groups of animals were sacrificed 2 hours after the last administration. In situ hybridization and in vitro receptor autoradiography were used in order to localize and quantify CB1 and D2 receptor mRNA levels and CB1 receptor binding levels, respectively. Western blotting was used to determine protein levels of D2 receptors. We found that administration of WIN55,212-2 leads to changes in CB1 receptor expression which, depending on brain region, were different between acute and chronic administration and a subsequent period of abstinence. More specifically, adult rats that received a single dose of WIN55,212-2 showed increased CB1 mRNA levels in the prefrontal cortex. The mRNA levels of CB1 receptor remained unchanged in the prefrontal cortex of rats that received WIN55,212-2 chronically. No changes were observed in receptor binding levels in both experimental models in this region. In striatum, acute and chronic administration of WIN55,212-2 brought a decrease in mRNA which was followed by a decrease in CB1 receptor binding levels. At this point, we need to highlight that CB1 receptor binding levels seem to return to control levels after a seven day period of abstinence. On the other hand, CB1 mRNA levels seem to revert to control levels after a twenty day period of abstinence. In substantia nigra, adult rats that received WIN55,212-2 chronically had decreased CB1 binding levels, whereas no change in receptor binding was observed in the model of acute administration. In addition, a single dose of WIN55,212-2 induced a decrease in CB1 mRNA levels in the dentate gyrus of hippocampus. Rats that received the agonist chronically showed increased CB1 mRNA levels in the CA1 region of hippocampus. Finally, regarding the dopaminergic system, we detected increased mRNA levels of the D2L isoform in substantia nigra pars reticulata and ventral tegmental area of chronically treated rats. D2L mRNA levels returned to vehicle levels after a seven day period of abstinence. In striatum, chronic administration of the agonist caused no statistically significant change in the protein levels of D2 dopamine receptor. The observed changes in CB1 receptor expression are thought to occur via epigenetic regulation in response to cannabinoid administration and may constitute a compensatory response.
Appears in Collections:Τμήμα Βιολογίας (ΜΔΕ)

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
Tsarouchi_Martha_MDE.pdf4.51 MBAdobe PDFView/Open


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.